인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

무균 인간 AB 혈청의 1 준비 신선한 냉동 혈장 (FFP)의 4-5 가방을 수집합니다. -20 ° C에서 보관 가방은 충분한 부대가 수집 될 때까지. 가방을 해동 및 보완을 비활성화하고 섬유소를 제거하기 위해 물을 욕조에 56 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 철저하게 가방의 외부를 소독하고 50 ml의 튜브에 플라즈마를 전송합니다. 실온에서 15 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기 침전물 및 잔여 혈소판을 제거 얻을 수 있습니다. 모든 상층 액을 풀과 알약을 폐기합니다. 나누어지는 혈청 15 ㎖의 튜브 샘플 및 저장 온도 -20 ° C에서. NOTE : 대안 적으로, 시판되는 열 – 불 활성화 된 정상 인간 AB 혈청을 사용할 수있다. 단핵구의 2 절연 원심 분리기의 분산을 용이하게하기 위해, 병렬로 두 버피 코트를 처리 할 것을 권장한다. 그러나, 캘리포니아을세포를 혼합하여 각각에 대해 별도의 도너 재료를 사용하지 재. 경우에 버피 코트를 쉽게 얻을 수없고, 헤파린 말초 혈액 400ml를 대신 사용할 수있다. 조심스럽게 버피 코트가 들어있는 비닐 봉지를 소독이 50 ml의 튜브에 각 버피 코트의 내용을 전송합니다. 각 버피 코트의 경우 15 ㎖의 피콜 용액 (1.077 g / ml)로 세 50 ml의 튜브를 입력합니다. 피콜 조제 실온에서해야한다. 제 층 밀도 구배 용 피콜 용액 위에 버피 코트 혈액 ML 30-35. 두 레이어를 혼합 방지하기 위해 천천히 조심스럽게 이렇게주의하십시오. 실온에서 30 분 동안 브레이크없이 400 XG에 원심 분리기. 각 구배를 들면 50 ㎖의 튜브에 플라스틱 파스퇴르 피펫 및 전사와 두 단계 사이에 위치 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 흰색 환을 모은다. 총 40 mL로 PBS-EDTA (1 mM)을 각각 튜브를 입력합니다. 실온에서 브레이크없이 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 기음 뜨는 및 40 ml의 PBS-EDTA (1 mM)을 다시 펠렛을 씻는다. 각 기증자 풀의 페놀 10 + 빨간색 %의 FCS없이 20 ㎖의 RPMI-1640의 펠렛. 초 밀도 구배에 대한 ISO 삼투 퍼콜 솔루션을 준비 :이 기증자 23.13 ml의 퍼콜 솔루션 믹스 (밀도 : 1.131 g / ㎖) 50 ㎖의 튜브와 1.87 ml의 10 배 PBS를. 이어서 50 ㎖의 새로운 튜브에 상기 용액 23 mL로 전송하고 46 % 이소 삼투 퍼콜 용액을 얻었다 페놀 레드 10 + %의 FCS와 함께 27 ml의 RPMI-1640을 추가한다. 퍼콜는 자료 실온에 있어야합니다. 50 ML 튜브로 제조 된 퍼콜 용액 25 ㎖의 각 기증자 전송 및 퍼콜 솔루션의 상단에 2.9에서 제조 된 PBMC 솔루션을) 층. 매우 느리게 이렇게 조심d를 조심스럽게 두 층이 쉽게 혼합하는 경향이있다. 정확하게하는 경우이 단계로 인해 색상들의 차이를 구별 할 수있다. 실온에서 30 분 동안 브레이크없이 550 XG에 원심 분리기. 각 그라데이션의 경우 50 ML 튜브에 플라스틱 파스퇴르 피펫 및 전송로 두 단계 사이에 위치 단핵구의 흰색 반지를 수집합니다. 총 50 mL로 PBS-EDTA (1 mM)을 각각 튜브를 입력합니다. 실온에서 브레이크없이 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기. 뜨는을 기음 페놀 10 + 빨간색 %의 FCS와 함께 20 ml의 RPMI-1640에 알약을 재현 탁. 대 식세포에 단핵구의 3 분화 트리 판 블루시 10 분 희석에 격리 된 단핵 세포의 수를 결정합니다. 만 단핵구 아르 큰 종종 불규칙 모양의 세포를 계산합니다. 림프구 수있는 작고 둥근 모양의 세포를 계산하지 마십시오. NOTE : 단핵구 숫자들은 단지 세포의 분화에 사용될 얼마나 많은 그리고 FEP 테프론 코팅 된 (소형 또는 대형) 잡화에 관한 힌트를 제공하기 때문에 너무 정확하게 결정될 필요가 없다. 한 기증자로부터 1.0-1.5 × 10 8 단핵구 들어 대규모 FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 물 주머니에 세포를 시드. 각 부대 174 ㎖의 RPMI-1640 (섹션 1에서 제조 된 바와 같이) 2 % 인간 AB 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2.5 NG / ㎖ M-CSF (180 ml의 총 부피)로 구성된 배양 배지를 준비한다. 한 기증자로부터 3.0-5.0 × 10 7 단핵구를 들어 작은 테프론 코팅 된 세포 배양 용기에 세포를 시드. 각 봉지 배지 285 ㎖의 RPMI-1640 (섹션 1에서 제조 된 바와 같이) 2 % 인간 AB 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2.5 NG / ㎖ M-CSF (30 ㎖의 총 부피)으로 이루어진 준비. 참고 : 예를 들어, 8.0 × 10 7 단핵 세포를 얻을 경우, 우리는 TW에서 그들을 시드 추천4.0 × 10 7 세포 각각 O를 작은 부피 가방. 대신, M-CSF에, 단구 대안 동일한 농도 (2.5 NG / ㎖)에서 과립구 대 식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF)와 구별 될 수있다. 준비된 배지에 세포 현탁액 (20 ml)에 조심스럽게 첨가하고 혼합한다. 이 백은 한 기증자로부터 제조하는 경우, 세포 현탁액에 20 ml의 RPMI-1640을 추가 한 다음 각 배지에 현탁 제제의 절반을 추가한다. 선택 사항 : 단핵구 준비가 무균 상태로있게되면 결정 혈액 한천 접시에 세포 현탁액 한 방울을 찢고 37 ° C에서 밤새 배양합니다. FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 가방의 플러그에 주사기 perfusor 50 ML의 외피를 조 준비된 세포 현탁액으로 채운다. 주사기를 분리하고 가방에 남아있는 공기를 밀어 넣습니다. 폐쇄 콘 가방을 닫습니다. 37 6-7일에 가방을 품어76, 5 % CO 2와 C. 4 대 식세포 수확 세포의 분리 (최대 3 시간 수의 배양을) 용이하게하기 위해 적어도 1 시간 동안 얼음에 차별화 된 대 식세포와 FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 가방을 놓습니다. 가방의 표면 전체가 얼음으로 덮여 있는지 확인합니다. 책상 / 보드의 모서리에 살짝 배와 가방을 당기십시오. 조심스럽게 가방의 외부를 소독하고 폐쇄 콘을 제거합니다. 가방의 플러그에 50 ML의 주사기를 조, 세포 현탁액을 제거하고 50 ML 튜브로 전송. 세포를 스핀 다운, 실온에서 10 분 동안 400 XG에서 원심 분리기. 뜨는을 대기음 총 10 ml의 RPMI-1640 + 10 % FCS에 한 가방에서 알약을 풀. 혈구의 세포 수를 결정 (1 : 4-1 : 트리 판 블루 10 희석). 만 대형 원형 셀을 계산합니다. NOTE : FEP 테플론 코팅 가방 식세포를 미분 한 후, 잔여 도너 세포와 단핵구 분리의 품질에 따라, 예를 들어 림프구가있을 수있다. FEP 테플론 코팅 된 가방을 다시 사용하려면 잔여 세포를 제거하기 위해 70 % 에탄올로 두 번 씻어. 50 ㎖의 70 % 에탄올로 채우고 하룻밤 배양한다. 가방, 멸균 PBS로 3 배 살균 종이에서 그들을 포장하고, 표준 절차를 사용하여 오토 클레이브 소독 세척 할 것. 주 : 세포 배양 가방 식세포 금리 손실없이 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 그러나 우리는 그들이 누출을 시작하기 전에 10 사용 후 가방을 폐기하기로 결정했다. RPMI-1640 + 10 % FCS 후속 실험 문화 대 식세포하십시오. 낮은 혈청 농도가 필요한 경우, 1 % FCS와 RPMI-1640에서 배양이 가능하다. 종자 3 ~ 4 시간 동안 배양 세포. 이 기간 후에는, 대 식세포가 세포 배양 접시 동안의 표면에 부착 유의어떤 오염 세포 (즉, 적혈구, 림프구, 수지상 세포) 서스펜션에있어. 비 부착 세포를 제거하는 PBS로 두 배 이상 세포를 씻으십시오. 상기 실험을위한 세포 배양 접시에서 배양 한 대 식세포를 분리, 신중 표면들을 긁어. 또한, 얼음에 20 분 동안 요리를 배양 배지를 흡인하고, 1 ml의 효소가없는 세포 분리 버퍼를 추가합니다. 37 ° C에서 5 분 배양 한 후, 아래로 최소 3 분 동안 4 ml의 PBS를 추가하고, 피펫 팅하여 세포를 분리합니다.