تحليل Phosphopeptide من القوارض بربخي المني
Summary
Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.
Abstract
الحيوانات المنوية هي فريدة من نوعها تماما بين أنواع الخلايا. على الرغم من أن تنتج في الخصية، يتم تبديل كل من النسخ الجيني النووي والترجمة من مرة واحدة تبدأ الخلية الجولة ما قبل المؤشر إلى استطال وتفرق في ما المعترف بها شكليا باعتباره الحيوان المنوي. ومع ذلك، فإن الحيوان المنوي هو غير ناضج جدا، عدم وجود القدرة على الحركة أو الاعتراف البيض. كل من هذه الأحداث وقعت مرة واحدة عبور الحيوانات المنوية جهازا الثانوية المعروفة باسم البربخ. خلال النهار مرور ~ 12 الذي يستغرقه خلية الحيوان المنوي بالمرور عبر البربخ، والتعديلات بعد متعدية من البروتينات الموجودة تلعب دورا محوريا في نضوج الخلية. واحد جانب كبير من هذا القبيل هو بروتين الفسفرة. من أجل توصيف الأحداث الفسفرة التي تحدث أثناء الحيوانات المنوية النضج، يجب وضع حد سواء النقي السكان الخلية الحيوانات المنوية وقبل تجزئة من phosphopeptides. باستخدام تقنيات الظهر فلاشينغ، وهي طريقة لعزل النقي الحيوانات المنوية سويرد F عالية الجودة والعائد من epididymides البعيدة أو الذيلية. يتم شرح الخطوات لإذابة، والهضم، وقبل تجزئة من phosphopeptides الحيوانات المنوية من خلال تيو 2 تقارب اللوني. مرة واحدة معزولة، phosphopeptides يمكن حقنها MS لتحديد كلا الحدثين الفسفرة البروتين على بقايا الأحماض الأمينية محددة وتحديد مستويات الفسفرة التي تحدث أثناء عمليات نضوج الحيوانات المنوية.
Introduction
وبعد أن خرجت من الخصية، الحيوانات المنوية والتباين الشديد بعد بشكل ملحوظ، وهذه الخلايا هي غير ناضجة 1،2. على هذا النحو، فإنها تفتقر ظيفة كاملة، بما في ذلك القدرة على السباحة وربط لبويضة 3. على الرغم من أن مزيدا من النضج للخلية الحيوان المنوي هو مطلوب، وهذا لا يمكن أن يتم عبر طرق الكنسي، ومنذ في هذه المرحلة من عملية تمايز الخلايا، وأنهم غير قادرين على النسخ الجيني والمزيد من البروتين الحيوي 4. ويمنح الاختصاص البيولوجي على الحيوانات المنوية عند خروجهم من الخصية وإدخال جزء من الجهاز التناسلي الذكري المعروف باسم البربخ 5. البربخ هو ملفوف بإحكام، أنبوب التباين الشديد الذي يربط القنوات صادر (الخصية) إلى الأسهر وموجود في جميع الثدييات الذكور 6. الحيوانات المنوية اكتساب تدريجيا إمكانية التسميد من خلال النسب بربخي، والاعتماد على البيئة اللمعية المتغيرة باستمرار التي هي كرعتيد من قبل الخلايا الظهارية بربخي المحلية 7. مختلف الأنشطة إفرازية وإعادة الاستيعابية الحالية في فعل بربخي الوسط لتعديل الحيوانات المنوية نفسها، وتغيير من البروتين، والكربوهيدرات والدهون تكوين 6. وقد تجسدت أهمية البربخ، وخاصة المنطقة الأولية "الفرد" هذا الهيكل باستخدام تقنيات ربط الجراحية 8. الحيوانات المنوية داخل الخصية المحتجزة من قبل ناقل القناة ربط تفتقر تماما في أي القدرة على تخصيب البويضة 9-11.
بالإضافة إلى البيئة بربخي، مسارات نقل الإشارة في إطار عمل الحيوانات المنوية لمرحلة ما بعد translationally تعديل تكملة الخلايا المنوية الموجودة. على سبيل المثال، الحيوانات المنوية من المناطق الأولى من البربخ عرض أنماط مختلفة من البروتين الفسفرة بالمقارنة مع تلك المناطق الأخيرة 5،12. وهذا ليس مستغربا لأن هناك اختلافات واسعة في جapability من الحيوانات المنوية من هذه المناطق. على سبيل المثال، الحيوانات المنوية من وقت مبكر، والفرد من البربخ وimmotilite. في المقابل، سوف الخلايا المنوية من منطقة ذيل الخضوع إلى الأمام الحركة التقدمية مرة واحدة وضعت في المتوسط متساوي التوتر. منذ خلايا بربخي الحيوانات المنوية غير قادرة على دي نوفو البروتين الحيوي، ويجب أن تكون جميع المسارات الجوهرية التي تنظم وظائف الحيوانات المنوية من خلال التعديلات بعد متعدية (PTM). وبالتالي، فإنه من المعقول أن البروتينات، وعلى وجه الخصوص يجب أن يكون التحقيق في PTMs مثل الفسفرة أحد المحاور الرئيسية إذا أردنا أن نفهم الحيوانات المنوية خلية النضج.
طريقة بديلة للحصول على الحيوانات المنوية من epididymidies لاستخدام-backflushing الرجعية 13-16. على الرغم من أن هذه التقنية هي بالتأكيد أكثر استهلاكا للوقت، ويأخذ درجة أكبر من المهارة من قبل المشغل، والحيوانات المنوية الحصول على إثبات باستمرار نقاء تتجاوز 99.99٪. وبالإضافة إلى ذلك، وعلى عكس جميع التقنيات الأخرى، كاليفورنيا الحيوانات المنويةن تكون معزولة في حالة هادئة، مما يجعل من الممكن لدراسة كيفية يبدأ الحيوانات المنوية على الحركة. كما تحضير العينة هو الجانب الأكثر أهمية لتحليل البروتين، وأصبح عزل الحيوانات المنوية واحدة من أهم جوانب دراسات الحيوانات المنوية بروتيوميك. يوفر هذا البروتوكول تفسيرا حول كيفية الحيوانات المنوية يتم عزل من البربخ الفرس. وفي أعقاب ذلك، ويرد الإجراء تخصيب 2 phosphopeptide تيو، مع إشارة محددة حول كيفية استخراج الببتيدات من الخلايا المنوية متباينة للغاية. ويمكن استخدام النهج MS التمييز phosphopeptides تغيير إذا كان للمرء أن يقارن بربخي الحيوانات المنوية الذيلية في دولة واحدة (immotile أو غير بالأهلية) إلى آخر (متحركة، بالأهلية، وكان رد فعل جسيم طرفي، الخ) مما يجعل هذا النهج قوية لدراسة الحيوانات المنوية وظيفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة لتحليل البروتين ناجحة وقابلة للتكرار من الحيوانات المنوية هي: 1) الطهارة من المواد ابتداء. 2) إزالة الأملاح غير المرغوب فيها والمنظفات. 3) تغيير طبيعة البروتينات إلى مداها الكامل وذلك للسماح التربسين لهضم ارتفاع العائد من البروتينات و4) التقليل من عينة التعامل مع للحد من فقدان الببتيد.
من أجل backflush البربخ الفرس بنجاح، لا بد من تحديد المنطقة التي من الحيوانات المنوية وخروج. في حالة كل من الفئران والجرذان، وهذا هو في ذروة منطقة مقعرة، في وسط المنطقة الذيلية من البربخ (انظر الشكل 2A). إذا كان أحد يأتي مزيد من نحو الأسهر، backflushing هو أسهل ونسبة النجاح أعلى عموما. ومع ذلك، وهذا يأتي في فقدان أعداد الحيوانات المنوية. بدلا من ذلك، إذا كان أحد يحاول التحرك أكثر الأقرب إلى المحكمة، ثم كمية الضغط اللازم لدفع الحيوانات المنوية مرة أخرى من خلال epididymالقنوات آل غالبا ما تكون عالية، لدرجة أن الأضرار التي لحقت البربخ يحدث لا محالة.
يتم تنفيذ Backflushing من البربخ تقليديا باستخدام المياه المشبعة الزيوت المعدنية ومحلول ملحي متوازن في الحقنة نفسها على أنها وسيلة لإزالة الحيوانات المنوية 22-25. كلا الإجراءات يمكن أن تكون إشكالية LC-MS. أولا، من المرجح أن منع نانو نانو C18 الأعمدة التي تستخدم أساسا في جميع أنحاء العالم لتحليل البروتين ويجب الحرص حتى يتم أن أيا قدما في إجراء المعدنية. إذا حدث هذا، فإنه من المستحيل أن يستمر ويتم فقدان العينة أساسا. هذا يمكن التغلب عليها عن طريق استخدام BWW أو حلول الملح متوازنة الأخرى في الحقنة، ولكن، على الرغم من أن هذا هو الناجح، فإننا سرعان ما اعترف بأن العديد من الحيوانات المنوية تصبح متحركة بأسرع ما جاء الحل BWW في الاتصال ومختلطة مع بربخي الذيلية الخلايا. للتحايل على هذه المشكلة ونحن ببساطة backflush الحيوانات المنوية مع الهواء. هو ليس فقط التأهيليةإيتي من الحيوانات المنوية مشابه لذلك من أساليب تعتمد على السائل، ولكن كمية غير متطابقة.
Phosphoproteomics ربما يكون واحدا من الطرق الوحيدة لإنشاء مسارات الإشارات التي تحدث في الحيوانات المنوية بعد القذف. واحد من المسارات الرئيسية نحن نحقق هو عملية تمكين الطاقات. الحيوانات المنوية يجب أن تخضع "تمكين الطاقات" قبل أنها قادرة على ربط إلى البويضة. في الممارسة العملية، ويتحقق هذا في الأساس التي يحتضنها الحيوانات المنوية لفترة من الوقت (40 دقيقة الماوس، الجرذان 1.5 ساعة، الإنسان 3-24 ساعة) في حل BWW مع ألبومين المصل. سابقا، نحن وغيرنا قد أظهرت دورا لعدة تحركات المشاركين في تمكين الطاقات. من الفائدة، حذف PKA μ II إنتاج الفئران التي تسبح بشكل عفوي في المختبر الحيوانات المنوية، ولكن لا يمكن الخضوع hyperactivation 26. وهذا الأخير هو السمة المميزة لتمكين الطاقات، حيث الحيوانات المنوية تغيير نمط السباحة الخاصة بهم من سرعة عالية، وانخفاض السعة، إلى أدنى مستوىالسرعة، ضربت السعة العالية التردد. لقد أظهرنا تحركات المصب تشارك في هذه العملية تشمل pp60-تنظيم الاوراق المالية (SRC) 13،27 ج-نعم 28 و ج-ABL 14. ومن المثير للاهتمام، وتثبيط SRC يتوقف تعتمد على تمكين الطاقات التيروزين الفسفرة 13. ومع ذلك، وهذا يمكن التغلب عليها مع حمض okadaic، مما يوحي بأن SRC لا تشارك مباشرة في بداية العام التيروزين الفسفرة 29 ولكن قد تنظم الفوسفاتيز 29. المشكلة مع استخدام BWW كوسيلة لإجبار الحيوانات المنوية من البربخ هو أنه بمجرد تفعيلها، والحيوانات المنوية الماوس فقط تأخذ حوالي 40 دقيقة توفير القدرة. وبالنظر إلى أن عزل الحيوانات المنوية قد يستغرق 5 دقائق / الماوس وغالبا ما تستخدم عدة فئران في التجربة، ثم الحيوانات المنوية سيكون في مراحل مختلفة من النضج في بداية التجربة. للتغلب على هذا، وضغط الهواء يمكن استخدامها لدفع الحيوانات المنوية من البربخ الذيلية في قنية الزجاج. هي كل inact الحيوانات المنوية ليس فقطإيف وأساسا لأنها يمكن العثور عليها في الوسط الذيلية، فإنه يجعل من الممكن مقارنة phosphoproteomics غير متحركة ومتحركة.
يجب أن تبقى التعامل مع phosphoproteomics عينة إلى أدنى حد ممكن عند مقارنة الحيوانات المنوية في دولتين وظيفية مختلفة. استخدام الميثانول الكلوروفورم على الطرق التقليدية الأخرى من البروتين هطول 1) يقلل من الحاجة إلى اتخاذ خطوات غسل اضافية، و2) يزيل تقريبا جميع آثار من الأملاح والدهون و3) لديه قدرة ثبت لترسيب البروتينات وفرة على ارتفاع منخفض فوق TCA 19. ويوصى هطول الأمطار البروتين قبل التربسين الهضم منذ وهذا لا يساعد على تفسد البروتين (الذي يساعد على الهضم التربسين)، ولكن يزيل الكثير من نواتج الأيض MS-تتنافى الموجودة في الخلية.
المقارنة بين phosphopeptides الحيوانات المنوية يمكن القيام به في عدد من الطرق. على المستوى الأساسي، وبمقارنة بسيطة من phosphopeptide المحددة في عينة واحدة، لأنه في آخرويمكن أن يتم العينة في عملية تعرف باسم "العد الطيفي". ومع ذلك كان الانتقاد في هذا النهج أساسا لأن الدراسات البروتين الأولى كانت تستخدم مكررات منخفضة (لمناقشة أشمل رؤية Lundren وآخرون 30). نهج أكثر تطورا هو أن ننظر إلى شدة الببتيد كتلة الأم ومقارنة هذا مع عينات أخرى (مقارنة خالية من التسمية). في المثال هو موضح في الشكل (4)، الببتيد غائبة عن من غير متحركة (الشكل 4 أعلى) ولكن موجودة في متحركة (الشكل 4 أسفل) الحيوانات المنوية من م / ض 650-670 يمكن رؤيتها. هذه العملية، ويشار إلى تسمية يستند إلى MS-الكمي الحرة هي استراتيجية خالية من التسمية.
استراتيجية بديلة تستخدم عادة لتقليل كمية من يدير المطلوبة لتقدير بروتيوميك هو استخدام النظائر. كما كتلة نظير مختلفة، مطياف الكتلة يمكن استخدامها لمقارنة شدة من elutالببتيدات جي. ومع ذلك، خلافا لمعظم أنواع الخلايا الأخرى، وبعض العلامات النظائر لا يمكن تطبيقها على الحيوانات المنوية. على سبيل المثال، إضافة النظائر المستقرة (يحصل على إضافة النظائر الثقيلة واحد لعينة واحدة، في حين نسخة أخف يحصل على إضافة إلى آخر) يمكن استخدامها في زراعة الأنسجة. عندما تحصل على دمج نظائر في البروتين، وتحليل البروتينات يمكن أن يؤديها من خلال الجمع بين اثنين من العينات (مضاعفة). ولكن في حالة الحيوانات المنوية، وهذا لا يمكن القيام به، وذلك ببساطة بحكم حقيقة أن 1) يتطلب وضع العلامات النظائر العديد من المقاطع (تصل إلى 8) في زراعة الأنسجة و2) خلايا الحيوانات المنوية لا يوجد لديه النسخ الجيني النووي والترجمة، وبالتالي، أنهم لا يستطيعون دمج نظائر في جميع البروتين على أية حال. طريقة واحدة لتجنب ذلك هي أن تأمر الفئران radiolabelled، ومع ذلك، وهذه هي مكلفة المعروف. نهج بديل هو استخدام علامة كيميائية. وقد تم ذلك عندما تمت مقارنة الفئران غير بالأهلية مع الفئران بالأهلية. في هذه الحالة، D 0 وD <subوقد استخدم> 3 -label للتمييز بين عينة واحدة، وآخر في مطياف الكتلة 31. ويمكن أن تشمل المناهج الأخرى استخدام iTRAQ (علامة إسوي الضغط عن الكميات النسبية والمطلقة)، حيث وصفت lysines كيميائيا مع النظائر الإعلام المختلفة. ICAT (النظائر مشفرة بطاقة تقارب) حيث وصفت cysteines مع النظائر الإعلام المختلفة ووضع العلامات المياه الثقيلة والخفيفة.
في كل حالة من الحالات، ومع ذلك، يحتاج إلى شيء واحد أن يوضع في الاعتبار. وMS تقارير فقط ما هو موجود في العينة، وهذا هو انعكاس لكل ما حدث إلى أن عينة تصل إلى تلك النقطة. التقليل من تناول عينة في حين تعظيم العائد في كل خطوة من الضروري لتحليل البروتين ناجحة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone | Aldrich | 195464 | |
| 2-D Quantitation Kit | VWR (GE Healthcare) | 80-6483-56 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A7030 | |
| Ammonia Solution 25% | Merck | 1.05432 | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | A6141 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C5080 | |
| CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate | Research Organics | 1300C | |
| Chloroform | BDH | 10077.6B | |
| di-sodium hydrogen phosphate | Merck | 1.06580 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | |
| Formic Acid | Sigma | O6440 | |
| Glucose | Sigma | G6152 | |
| Glutamine-L | Sigma | G7513 | |
| Hepes (free acid) | Sigma | H3375 | |
| Iodoacetic acid free acid | Sigma | I4386 | |
| Lactic Acid | Sigma | L1750 | |
| Magnesium Chloride | Res. Org. | 0090M | |
| Methanol | Merck | 10158.6B | |
| Percoll (sterile) | VWR (GE Healthcare) | GEHE17-0891-01 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt | ThermoFisher Scientific (Pierce) | PIE78420 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium Hydrogen Carbonate | Medical Store | CH 600 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S3817 | |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium di-hydrogen phosphate | Merck | 1.06346 | |
| Sodium hydrogen carbonate | BDH | 10247.4V | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Tris Ultra Pure Grade | Amresco (Astral) | AM0497 | |
| Trypsin Gold-Mass Spec Grade | Promega | V5280 | |
| Urea | Sigma | U5128 | |
| Zinc Chloride | Sigma | Z0173 | |
| 0.4 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317100 | |
| 30 gauge needle | Terumo | NN2038R | |
| 3 mL syringe | Terumo | SS035 | |
| 4.2 mm polyethylene tubing | Goodfellow | ET317640 | |
| Braided silk (5-0) | Dynek | CSS0100 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 299537 | |
| TiO2 beads (from disassembled column) | Titansphere | 6HT68003 | |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 22431081 | |
| C7B30 | Sigma | C0856 |
References
- Blandau, R., Rumery, R. E. The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity. Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).
- Tournade, A. Différence de motilité des spermatozoïdes prélevés dans les divers segments de l’épididyme. C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).
- Wyker, R., Howards, S. S. Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa. Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).
- Eddy, E. M. Male germ cell gene expression. Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).
- Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. . Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75 (4), 588-597 (2006).
- Jones, R. Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis. J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).
- Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C., Neill, J. D. . The Epididymis. 3, 1072-1120 (2006).
- Lacham, O., Trounson, A. Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte. Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).
- Bedford, J. M. Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis. J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).
- Orgebin-Crist, M. C. Studies on the function of the epididymis. Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).
- Orgebin-Crist, M. C. Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement. J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).
- Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization. Reproduction. 124, 107-117 (2002).
- Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa. J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).
- Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation. Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).
- Baker, M. A., et al. Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation. J. Proteome. Res. 10 (3), 1004-1017 (2010).
- Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS. Metabolomics. 11, 1-14 (2012).
- Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. . The culture of mouse embryos in vitro. , (1971).
- Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).
- Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide. Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).
- Thingholm, T. E., Larsen, M. R. The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests. Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).
- Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent. Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).
- Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation. Biol. Reprod. 69 (6), 1801-1807 (2003).
- Jones, R., Mann, T., Sherins, R. Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma. Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).
- Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis. Reproduction. 125, 175-183 (2003).
- Nolan, M. A., et al. Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).
- Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa. Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).
- Leclerc, P., Goupil, S. Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3′,5′-monophosphate and inhibition by Ca(2). Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).
- Krapf, D., et al. Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors. J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).
- Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. Role of spectral counting in quantitative proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).
- Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins. J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).
