메추라기 오리 키메라를 사용하여 두개 안면 개발에 종 - 특정 포스트 평가

1. 텅스텐 바늘을 준비한다 로드가 구부러지지 않도록 와이어 커터를 사용하여 반으로 텅스텐 막대를 잘라. 5 붕규산 유리의 3 / 4 파스퇴르 피펫의 테이퍼 말까지로드 실. 유리로로드 고집의 약 3 / 4 떠나, 풀 총에 사용되는 접착제 지팡이입니다 "핫 멜트 접착제"(HMA)의 작은 구슬과 피펫 팁에 막대를 준수합니다. HMA는 신속하게 접착제를 태워 검은 색 연기가 발생하지 않도록주의를 복용, 알코올 불꽃에 녹아해야합니다. 겸자의 쌍을 사용하여, 45 ° 각도에 도달 할 때까지 (약 1 / 4의 상단부로부터) 텅스텐로드의 선단을 굽혀. 파스퇴르 피펫을 잡고, 프로판 토치의 불꽃에 텅스텐 막대의 끝 부분의 약 1 / 8을 배치합니다. 끝이 꾸준하고 화염에 정확히 수직으로 잡습니다. 불꽃의 주사 바늘을 당겨 순간 tungs의 작은 오렌지 얼룩바늘의 오프 열 파리. 2. 스페 피펫을 준비 곧 테이퍼 넘어 유리가 녹기 시작할 때까지 분젠 버너를 사용, 파스퇴르 피펫의 좁은 끝을 가열한다. 불꽃에서 제거하고 피펫이 봉인 될 때​​까지 끝을 당겨. 약 0.7 ~ 1.0 mm의 외경을 가지고 테이퍼 부분의 일부가 남아 있는지 확인합니다. 테이퍼에서 약 4cm 떨어져 밀봉 끝을 휴식. 피펫의 넓은 (오픈) 끝 부분에 고무 튜브의 약 2 피트 (60cm)를 연결합니다. 공기는 파스퇴르 피펫의 테이퍼 부분을 통과하지 못하도록 보장하기 위해 고무 튜브의 타단에 불어. 부속 연필 불꽃 토치 프로판 연료 실린더를 사용하여, 단지 테이퍼 개시 아래 피펫 한쪽 타원형 영역을 가열한다. 압력 소량의 (편지시의 시작을 말하는 데 필요한 압력의 정도 양에 고무 튜브를 매우 부드럽게 지속적으로 공기를 불어대화 수준의 R "P"). 유리가 한면에 부드러운되고 바깥쪽으로 버클을 시작하면 신속하게 불꽃에서 피펫을 제거하고 고무 튜브를 통해 하드와 꾸준한 타격. 이 유리의 가열 된 부분이 잘되는, 팝 수있는 소시지 모양의 거품을 형성하게됩니다. 거품이 너무 작은 경우, 용융 후 다시 유리 불고 시도. 유리의 마지막 열려있는 창 넓은 길이 (12.7 ㎜)의 0.5 (6.35 ㎜)에 0.25를 해결해야한다. 테이퍼 단부 포인팅 위쪽으로 부드럽게 피펫 들어가는 유리 파편을 막기 위해 튜브를 통해 불고있는 동안 유리 폐기물 컨테이너로 버블을 긁어. 프로판 불꽃을 사용하여 거품과 불 닦으 열린 창문의 양쪽의 나머지 가장자리를 구울 수 있습니다. 피펫의 축 녹지 않도록주의하십시오. 다이아몬드 포인트 연필을 사용하여 창 (30 ㎜)의 약 1.25 피펫의 테이퍼 끝을 점수 및 팁을 해소집게로 피펫 구멍이 깨끗하게 (깨지거나 고르지 팁 폐기 피펫을) 절단되도록. 집게를 사용하고 굴곡부가 수직 평면에 있도록 알코올 버너 화염의 가장자리는, 약 60 °의 각도로 끝에서 (9.5 mm)에 피펫 0.375의 좁은 부분을 구부릴 때 윈도우 개구 왼손 사용을 위해 오른손 사용 11:00에 대한 1시 위치에있다. 이 단계는 가장 초안없는 인클로저에 실시됩니다. 불 닦으 해부 현미경 주류 불꽃을 사용하여 팁. 끝을 봉쇄 아니라 오프닝 라운드를 유지하고 굴곡없이 매끈하게하지 말아주십시오. 고무 튜브의 1 (25 ㎜) 조각을 잘라 70 % 에탄올로 튜브의 조각을 살포하고, 창 개방이 완전히 덮여 때까지 피펫의 축에 튜브를 밀어 넣습니다. 이 스페 피펫의 "격막"로 작동합니다. 라텍스 고무 2 ㎖ 전구를 배치피펫의 오픈 바닥에. 전구는 스페 피펫에 부정적인 압력을 유지합니다. , 스페 피펫을 사용하여 연습을 현미경으로 다른에 표시된 지점에 하나의 배양 접시에 표시된 지점에서 직경이 약 100 ~ 200 ㎛, 크로마토 그래피 비즈를 전송합니다. 스페 피펫을 청소하려면 바닥면 또는 거즈로 줄 지어 증류수와 유리 세제로 가득 키가 큰 비커에, 아래 팁, 고무 전구 및 장소 피펫을 제거합니다. 3. 계란 살균을 품다 70 % 에탄올로 계란을 닦아 및 플라스틱 계란 트레이에 계란을 넣습니다. 37.5 ° C와 85-87%에서 가열 된 인큐베이터에서 계란을 설정합니다. 그들은 HH9.5, 메추라기와 오리 48 시간 동안 약 26 시간에 도달 할 때까지 알을 품다. 4. 창 계란 내부 쉘 m에 구멍 않도록주의하면서, 집게로 계란의 상단에서 바깥 쪽의 작은 조각을 제거합니다embrane. 1 인치 바늘로 18 G 주사기를 사용하여 계란의 좁은 끝 부분에 구멍을 찌르고 알부민의 약 1 ~ 2 ㎖의 철회. 쉘에있는 구멍과 구멍 표시에 투명 테이프를 넣습니다. 곡선 가위를 사용 (투명 테이프를 통해) 계란의 표면을 따라 "창"을 잘라. 5. 태아를 시각화 및 수술 준비 유리 막대를 사용하여 부드럽게 배아 위에 중성 레드 소량 (행크의 BSS에서 0.02 g / ㎖)를 브러시. 난황 막 컷 불꽃 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용하여 배아에 당깁니다. 창에 투명 테이프를 배치하여 계란을 다시 봉인. 6. 기증자의 배아에서 기증자의 조직을 분리 기증자의 배아의 계란 창에서 테이프를 제거합니다. 기증자의 배아 인접한 외배엽에서 신경 배를 잘라, SID 모두에 슬릿을(전술 한 바와 같이 제조 된) 화염 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용 신경관의 에스. 그 후, 이식 원하는 전방 및 후방 수준에서 신경 튜브 가로 질러 및 신경 튜브의 나머지 부분에서 이식을 분리합니다. 스페 피펫 또는 마이크로 피펫의 다른 유형을 사용하여 기증자의 배아에서 신경 배를 제거합니다. 그런 다음, 호스트 계란 창에서 테이프를 제거하고 이식을받을 신경관의 영역에 인접한 호스트 배아 함께 기증자 신경 배를 배치 스페 피펫을 사용합니다. 7. 호스트 조직을 분리하고 기증자의 조직 이식 기증자로 수행으로, 호스트 태아의 신경관에서 신경 배를 분리합니다. 기증자의 조직과 동일한 크기의 이식을 제거하기 위해주의하십시오. 부드럽게 멀리 배아에서이 호스트 조직을 누릅니다. 그런 다음, 무딘 텅스텐 바늘 또는 MI의 둥근 팁cropipette 부드럽게 적절한 전후면 및 dorso – 복부 방향을 유지, 기증자 신경 호스트 신경 튜브에 접어 이동합니다. 이식이 측면을 따라 자리 잡고 있습니다 있는지 확인하지만 찌를 또는 기본 조직에 손상되지 않도록해야합니다. 원래 방향 노트의 중립 레드에서 기증자의 조직 또는 차등 염색의 모든 비대칭을 추적 할 수 있도록하십시오. 또한 광 문서 수반 적출 조직뿐만 아니라 키메라와 도너 배아 즉시 수술 다음. 호스트 배아가 건조의 흔적이있는 경우 멸균 식염수는 계란에 추가해야합니다. 이제 조심스럽게 재 밀봉하고 알을 레이블을 조심스럽게 키메라 배아 분석을 위해 원하는 단계로 발전 할 수 습도가 높은 인큐베이터 (70-80 %)로 돌아갑니다. 키메라의 8. 컬렉션 갓 만든 차가운 세라의 정착에 키메라 배아를 수집하고 즉시 RO에 배치해야합니다O / N 고정 용 4 ° C에서 cker. 이것은 안티 – 메추라기 항체와 메추라기 세포의 민감한 탐지를 위해 수 있습니다. 유전자 발현은 RT-qPCR에를 통해 분석의 경우, 이전의 RNA 추출에 액체 질소에 직접 배아를 동결.