To-foton<em> In vivo</em> Imaging af dendritiske spidser i Mouse Cortex Ved hjælp af en tyndere-kranium Forberedelse
Summary
Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.
Abstract
I pattedyr cortex neuroner danner ekstremt komplicerede netværk og udveksle information på synapser. Ændringer i synaptisk styrke, såvel som tilsætning / fjernelse af synapser, forekommer i en oplevelse-afhængig måde, som giver den strukturelle fundament af neuronal plasticitet. Som postsynaptiske komponenter af de mest excitatoriske synapser i hjernebarken, er dendritiske Torner anses for at være en god proxy af synapser. Tager fordelene ved muse genetik og fluorescerende mærkningsteknikker, individuelle neuroner og deres synaptiske strukturer kan mærkes i den intakte hjerne. Her introducerer vi en transkranial billedbehandling protokol ved hjælp af to-foton laser scanning mikroskopi at følge fluorescensmærkede postsynaptiske dendritiske Torner over tid in vivo. Denne protokol udnytter en udtyndede kranium præparat, der holder kraniet intakte og undgår inflammatoriske virkninger forårsaget af udsættelse i hjernehinden og cortex. Derfor kan billederne erhverves umiddelbart efter surgery udføres. Den eksperimentelle fremgangsmåde kan udføres gentagne gange over forskellige tidsintervaller spænder fra timer til år. Anvendelsen af dette præparat kan også udvides til at undersøge forskellige kortikale regioner og lag, samt andre celletyper, under fysiologiske og patologiske tilstande.
Introduction
Pattedyr cortex deltager i mange hjernefunktioner, lige fra sansning og bevægelse kontrol til abstrakte informationsbehandling og kognition. Forskellige kortikale funktioner bygger på forskellige neurale kredsløb, der består af forskellige typer af neuroner meddele og udveksle oplysninger på de enkelte synapser. Struktur og funktion af synapser er konsekvent at blive ændret som reaktion på erfaringer og patologier. I den modne hjernen, synaptisk plasticitet tager form af både styrke ændringer og tillæg / fjernelse af synapser, spiller en vigtig rolle i dannelsen og vedligeholdelsen af en funktionel neurale kredsløb. Dendritiske spidser er de postsynaptiske komponenter i størstedelen af excitatoriske synapser i pattedyrs hjerne. Den konstante omsætning og morfologiske ændringer af pigge menes at tjene som en god indikator for ændringer i synaptiske forbindelser 1-7.
To-foton laser scanning mikroscopy tilbyder dybe indtrængen gennem tykke, uigennemsigtige præparater og lav fototoksicitet, hvilket gør den velegnet til billeddannelse i den intakte hjerne 8. I kombination med fluorescerende mærkning, to-foton billedbehandling giver et kraftfuldt værktøj til at kigge ind i levende hjerne og følg strukturrationalisering på de enkelte synapser med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Forskellige metoder er blevet anvendt til fremstilling af mus for levende billeddannelse 9-13. Her beskriver vi et præparat af in vivo to-foton imaging tyndet-kranium for at undersøge den strukturelle plasticitet postsynaptiske dendritiske Torner i musen cortex. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, har vores seneste undersøgelser afbildet et dynamisk billede af dendritiske rygsøjlen ændringer som reaktion på motorik læring Med stigende tilgængelighed af transgene dyr med fluorescensmærkede neuronale delmængder og hurtig udvikling af in vivo mærkning af teknikker, kan lignende procedurer er beskrevet her også anvendes til undersøgelsete andre celletyper og kortikale regioner, kombineret med andre manipulationer, samt anvendes i sygdomsmodeller 16-23.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at opnå en succesfuld udtyndede kranium forberedelse, flere trin i denne protokol er afgørende. 1) Tykkelsen af kraniet. Kranieknoglen har en sandwich struktur med to lag af high-density kompakt knogle og et midterlag af lav densitet svampet knogle. Mens høj hastighed mikro boret er velegnet til at fjerne de ydre lag af kompakt knogle og svampet knogle, det mikrokirurgiske bladet er ideel til udtynding det indre lag af kompakt knogle. Som tykkelsen og stivheden af kraniet stiger under udvikling, bille…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker James Perna for grafisk illustration. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institute of Mental Health til YZ
Materials
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
References
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
- Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
- Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
- Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
- Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
- Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. , (2012).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
- Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
- Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
- Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
- Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
- Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
- Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. , (2010).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. , (2010).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. , (2012).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. , (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. , (2010).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
- Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).
