ホット生物触媒：等温滴定熱量測定酵素反応を特徴づけるために
Summary
熱流が化学反応で放出又は吸収等温滴定熱量測定する。この方法は、酵素触媒作用を定量化するために使用することができる。本論文では、楽器の設定、実験の実行、およびデータ分析のためのプロトコルは、一般的に説明されており、ナタマメウレアーゼによる酵素尿素加水分解の評価に適用。
Abstract
等温滴定熱量測定（ITC）は、ほぼすべての化学プロセスを特徴付けるために固有のプローブとして使用して、化学反応の間に放出または吸収される熱を測定する十分に記載された技術である。今日では、この技術は、広く生体分子の結合平衡の熱力学的パラメータを決定するために適用される。また、ITCは直接アプリケーションがまだunderexploitedであっても、酵素反応の動力学及び熱力学的パラメータ（ の k cat、K M、ΔH）を測定できることが実証されている。熱変化は、自発的に酵素触媒反応中に発生するように、ITCは、分析中のシステムの任意の改変または標識を必要とせず、溶液中で行うことができる。さらに、この方法は、材料の少量を必要とする。これらのプロパティは、ITCのようないくつかのアプリケーションでは、例えば、薬剤の発見に酵素反応速度を研究するために、非常に貴重な、強力でユニークなツールとなっています。
<p c本研究でlass = "jove_contentは">の酵素反応の速度論と熱力学を定量化するための実験的なITCベースの方法を十分に説明されている。このメソッドは、Canavalia ensiformis（ジャック豆）ウレアーゼによる尿素の酵素加水分解のK 猫とK Mを決定するために適用される。反応の固有のモルエンタルピー（ΔHの整数 ）の計算が行われる。このようにして得られた値は、方法の信頼性を実証する、文献に報告され、以前のデータと一致している。Introduction
生化学反応の定量は生命の基礎で生物学的プロセスへの洞察を提供しています。熱量測定を定量的に、溶液中のほぼすべての化学反応を特徴づけるラベルフリーの方法論を提供しています。この技術は、経時的に放出または吸収される熱を測定し、したがって、分子（ 即ち、結合熱力学）を反応させるの量を定量化するため、ならびに反応速度（ すなわち、反応速度）を測定するためのユニバーサル検出システムと非常に便利な方法である。特に、等温滴定熱量測定（ITC）は、タンパク質-リガンド、タンパク質-タンパク質、タンパク質-金属イオンおよびタンパク質-DNA相互作用1-6伴う、生体分子の熱力学平衡を特徴付けるための選択の方法として採用されている。本出願の電位がまだあるがまた、動力学的情報を提供するITCの能力は、その酵素触媒を測定するための非常に強力なシステムとなる7-9を過小評価していた。
ミカエリス定数（K M）および触媒速度定数（k cat）を ：は、2つの動態パラメータに応じて、反応速度及び基質濃度との関係を提供するので、ミカエリス-メンテン式10は 、酵素反応の定量的記述である。 の k cat / K M比が酵素の触媒効率と呼ばれる。実際には、特定の反応のために、K、MとKの猫の決定は、触媒作用の完全な説明を提供しています。
典型的な酵素反応（ 図1）において、基板（S）は、その後、遷移状態中に活性化される酵素-基質（ES）複合体を形成する酵素（E）、（ES *）と相互作用する。後者は、最終的には解離し、酵素生成物（EP）錯体に変換される。これらのステップsが、以下の反応により記載されている。
（1）
k 1は ES複合体の形成の速度定数である場合の k cat は触媒速度定数またはターンオーバー数であるが、kが-1、ES複合体の解離の速度定数である。
ミカエリス·メンテン式10によれば、反応速度は次のように計算できます。
（2）
ここで、K、M =（K -1 + K 猫 ）/ K 1とK 猫 = V maxは / [E]、V maxは 、すべての酵素が基質に結合されたときに到達した最大速度であることと。
等温滴定熱量計は、尿素の酵素的加水分解を特徴づけるためにこの研究で使用される機器である。この器具は、2つの造語状細胞（ 図1）を含有する断熱シールドで形成されている。これらは、狭いアクセスチューブと外部に接続されている。基準セルは、一般に水または分析のために使用される溶媒で満たされている間に試料セル（ 約 1.4ミリリットル）を、酵素溶液でロードされる。通常、基質溶液の約0.3 mlを含む長い針及び取り付けられた攪拌パドルを有する回転注射器は、試料セルに取り付けられている。熱電素子」とは、細胞フィードバックネットワーク」を用いて、試料と参照セルとの間の温度差を測定し、熱を加算または減算することによってゼロにあるこの差を維持する。実験中、基板は、一定の選択された温度で酵素溶液に注入される。ときはアンzymatic反応は、放出又は吸収される熱の量は、生成物分子に変換される基質分子の数に比例する、起こる。また、熱流の速度を直接反応速度に関係する。最初のベースラインからの熱痕跡のずれ（ 図1）として現れる測定データは、試料セルで発生する熱流に比例した試料セルに機器によって供給される熱出力（μcal/秒）を表す時間をかけて。
図1。酵素反応を研究するための等温滴定熱量計の概略図。酵素反応は、酵素溶液に（注射器）に基板の滴定の際に発生する（試料セル内）THERの変化をもたらすサンプルセルとリファレンスセル定数の温度差を維持するのに必要な熱量計によってリリースMALパワー、。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
全体的に、熱変化（Q）は、反応（ΔH）のモルエンタルピーひいては全体積倍の濃度で与えられる（n）が生成された生成物のモル数に比例する。
（3）
反応速度に対応する時間（のdP / dt）は上の生成物の形成は、このようにして関係を介して、同時に（dQ / dtは）上で発生した熱の量に関連することができる。
（4）
この式によれば、ミカエリス-メンテンプロットを得るためには、私を測定する必要がある）合計モルエンタルピーΔH、および異なる基質濃度でdQ / dtは ii）の熱流。通常、これは、2つの異なる実験で行われる：第一の実験（ 方法1、M1）において、基質は、酵素溶液中に注入され、完全な基質変換のための熱を測定する;第二の実験（ 方法2、M2）は、基板の複数回の注入が行われ、熱発生の速度は、異なる基質濃度で測定される。これら2つのデータセットは、動力学的パラメーターK Mおよびkの猫を導出するのに十分である。
本記事では、ITCを用いて行われる酵素反応のための速度論的パラメータを決定する一般的なプロトコルが記載されている。私たちは、Canavalia ensiformis尿素により尿素加水分解法を適用それ自体、基準システムとして。この方法を用いて得られた結果を、文献に報告されたデータとの間の良好な一致は、このアプローチの信頼性を実証する。
Protocol
Representative Results
Discussion
既存の方法に関連して酵素活性を研究するITCの意義
結合平衡を研究するための古典的な用途に加えて、等温滴定熱量計は、システムの改変または標識を必要とせずに、プローブとして反応熱を用いて溶液中で酵素反応を特徴付けるため信頼性が高く、迅速な方法を提供する。速度論的パラメータは猫を kとK Mは 、通常、生成物?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
スペシャリティ肥料製品会社（SFP）は、この研究のために必要な資金を提供するために認められている。
Materials
| HEPES | Sigma | H3375 | dissolving in water and adjusting pH with NaOH |
| TRIZMA-Base | Sigma | T1503 | dissolving in water and adjusting pH with HCl |
| Sodium dihydrogen phosphate | Riedel-de-Haen | 4270 | dissolving in water |
| Sodium phosphate dibasic | Riedel-de-Haen | 30427 | dissolving in water |
| Urea | Sigma | U4128 | dissolving in water at 40 °C |
| Canavalia ensiformis urease (type C-3) | Sigma | U0251 | dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C |
| VP-ITC on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | SYS13901 | instrument |
| VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0 | MicroCal (GE Healthcare) | data acquisition software supplied with the instrument |
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