Mätning Spinal Presynaptiska Hämning i möss genom Rygg-rota Potential inspelning<em> In Vivo</em
Summary
GABAergic presynaptisk hämning är en kraftfull inhiberande mekanism i ryggmärgen viktigt för motorisk och sensorisk signal integration i ryggmärgs nät. Underliggande primära afferenta depolarisation kan mätas genom registrering av dorsala potentialer (DRP). Här visar vi en metod för att in vivo-inspelning av DRP i möss.
Abstract
Presynaptisk hämning är en av de mest kraftfulla hämmande mekanismer i ryggmärgen. Den bakomliggande fysiologiska mekanismen är en depolarisation av primära afferenta fibrer som förmedlas av GABAergiska AXO-axonal synapser (primära afferenta depolarisation). Styrkan hos primära afferenta depolarisation kan mätas genom registrering av volymfördes potentialer vid den dorsala (dorsala potentialer, DRP). Patologiska förändringar av presynaptiska hämning är avgörande i det onormala centrala bearbetningen av vissa smärttillstånd och i vissa störningar i motor hyperexcitabilitet. Här beskriver vi en metod för inspelning DRP in vivo i möss. Beredningen av ryggmärgs dorsala rötter i den sövda djur och registreringsförfarande med hjälp av sug elektroder förklaras. Denna metod gör det möjligt att mäta GABAergic DRP och därmed uppskatta spinal presynaptisk hämning i den levande mus. I kombination med transgena musmodeller får DRP inspelning SErve som ett kraftfullt verktyg för att undersöka sjukdomsassocierade spinal patofysiologi. In vivo-inspelning har flera fördelar jämfört med ex vivo isolerade ryggmärgs preparat, t.ex. möjligheten till samtidig inspelning eller manipulation av supraspinala nätverk och induktion av DRP genom stimulering av perifera nerver.
Introduction
Presynaptisk hämning är en av de mest kraftfulla hämmande mekanismer i ryggmärgen. Det hämmar excitatoriska postsynaptiska potentialer (EPSPS) i monosynaptically glada motoneuroner utan att ändra postsynaptiska membranpotentialen och retbarhet av motoneurons 1-3. Primära afferenta depolarisation (PAD) inducerad av GABAergiska AXO-axonal synapser på sensoriska presynaptiska fibrer är den bakomliggande mekanismen 4-7 (se även Figure1a). Dessa synapser innehåller GABA A-och GABA-B-receptorer (GABA A R och GABA B R). GABAA-R-aktivitet leder till en ökning i kloridkonduktans som framkallar PAD grund av den lokala jon distribution. Denna depolarisation blockerar spridning av aktionspotentialer i axon terminaler och minskar sin styrka som leder till en minskad Ca2 +-inflöde och en minskning av transmittorfrisättning. Aktivering av GABA-B-receptorer gör ingent bidra till PAD men leder till en minskning av Ca2 +-inflöde därmed öka presynaptiska inhibition. Även om aktiveringen av GABA A R verkar vara inblandade i korttids hämning, är GABA B R inblandade i långsiktiga module 8-10. Förutom GABA, som står för den största delen av PAD och presynaptisk hämning kan andra sändare system också modulera och bidra till denna mekanism 11,12.
Patologiska förändringar i presynaptiska hämning verkar vara avgörande i flera sjukdomstillstånd, t.ex. perifer inflammation och neuropatisk smärta 13,14, liksom onormal central smärta bearbetning 15, ryggmärgsskada 16, och CNS-sjukdom med motor hyperexcitabilitet förmedlas av defekt GABAergic överföring 17, 18. Således uppskatta presynaptisk hämning är värt att undersöka experimentella sjukdomstillstånd på ryggmärgen nivå in vivo </em>. PAD ger upphov till volymfördes potentialer som ger ett direkt mått på den presynaptiska inhiberingen i ryggmärgen. Dessa potentialer kallas dorsala potentialer (DRP) och kan mätas från ryggmärgen dorsala rötter efter stimulering av intilliggande dorsala rötter 7.
De första mätningarna av DRP har rapporterats hos katter och grodor 19 och var intensivt studerat hos katter från Eccles, Schmidt, och andra i början av 1970-talet 3,4,20,21. Medan in vivo-inspelningar av DRP hos katter 22 och råttor 23 har använts i stor utsträckning, mätningar i möss har nästan uteslutande utförts i ex vivo isolerade ryggmärgen förberedelser 15,24. Här beskriver vi en metod för att spela in DRP i bedövade möss in vivo tillåter ett direkt mått på presynaptisk hämning i den intakta organismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Extra-och intracellulära elektrofysiologiska inspelningar av nervaktivitet och synaptiska potentialer in vivo är toppmoderna tekniker för att utreda CNS-neuronala funktioner och patofysiologi. Spinal integration är avgörande för motorik, t.ex. lem rörelse och för multimodal sensorisk perception. Presynaptisk hämning är en viktig mekanism i detta beräkningsprocess säkerställer lämpliga svar på sinnesintryck. GABAergic synapser på Ia afferenta fibrer hämmar excitation av motoneuroner av …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Manfred Heckmann för bra diskussioner under upprättandet av metoden. Vidare tackar vi Claudia Sommer för tekniskt bistånd och Frank Schubert för stöd producera video. Arbetet stöddes av förbundsministeriet för utbildning och forskning (BMBF), Tyskland, FKZ: 01EO1002 och tvärvetenskapligt center för klinisk forskning (IZKF) i Jena Universitetssjukhus.
Materials
| Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
| Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
| (Melsungen, Germany) | |||
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
| Ketamin 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
| 30G micro needle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
| (Melsungen, Geramny) | |||
| Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
| S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
| Stimulator | |||
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
| InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
| Data acquisition | |||
| Universal amplifier | npi (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
| Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
| Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
| Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
| Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |
References
- Eccles, J. C., Eccles, R. M., Magni, F. Central inhibitory action attributable to presynaptic depolarization produced by muscle afferent volleys. J. Physiol. 159, 147-166 (1961).
- Levy, R. A. The role of gaba in primary afferent depolarization. Prog. Neurobiol. 9, 211-267 (1977).
- Eccles, J. C., Magni, F., Willis, W. D. Depolarization of central terminals of Group I afferent fibres from muscle. J. Physiol. 160, 62-93 (1962).
- Eccles, J. C., Schmidt, R., Willis, W. D. Pharmacological Studies on Presynaptic Inhibition. J. Physiol. 168, 500-530 (1963).
- Maxwell, D. J., Bannatyne, B. A. Ultrastructure of muscle spindle afferent terminations in lamina VI of the cat spinal cord. Brain Res. 288, 297-301 (1983).
- Barber, R. P., Vaughn, J. E., Saito, K., McLaughlin, B. J., Roberts, E. GABAergic terminals are presynaptic to primary afferent terminals in the substantia gelatinosa of the rat spinal cord. Brain Res. 141, 35-55 (1978).
- Wall, P. D., Lidierth, M. Five sources of a dorsal root potential: their interactions and origins in the superficial dorsal horn. J. Neurophysiol. 78, 860-871 (1997).
- Rudomin, P. In search of lost presynaptic inhibition. Exp. Brain Res. 196, 139-151 (2009).
- Rudomin, P., Schmidt, R. F. Presynaptic inhibition in the vertebrate spinal cord revisited. Exp. Brain Res. 129, 1-37 (1999).
- Kullmann, D. M., et al. Presynaptic, extrasynaptic and axonal GABAA receptors in the CNS: where and why?. Prog. Biophys. Mol. Biol. 87, 33-46 (2005).
- Hochman, S., Shreckengost, J., Kimura, H., Quevedo, J. Presynaptic inhibition of primary afferents by depolarization: observations supporting nontraditional mechanisms. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 140-152 (2010).
- Thompson, S. W., Wall, P. D. The effect of GABA and 5-HT receptor antagonists on rat dorsal root potentials. Neurosci. Lett. 217, 153-156 (1996).
- Enriquez-Denton, M., Manjarrez, E., Rudomin, P. Persistence of PAD and presynaptic inhibition of muscle spindle afferents after peripheral nerve crush. Brain Res. 1027, 179-187 (2004).
- Wall, P. D., Devor, M. The effect of peripheral nerve injury on dorsal root potentials and on transmission of afferent signals into the spinal cord. Brain Res. 209, 95-111 (1981).
- Witschi, R., et al. Presynaptic α2-GABAA Receptors in Primary Afferent Depolarization and Spinal Pain Control. J. Neurosci. 31, 8134-8142 (2011).
- Calancie, B., et al. Evidence that alterations in presynaptic inhibition contribute to segmental hypo- and hyperexcitability after spinal cord injury in. 89, 177-186 (1993).
- Geis, C., et al. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
- Geis, C., et al. Human IgG directed against amphiphysin induces anxiety behavior in a rat model after intrathecal passive transfer. J. Neural Transm. 119 (8), 981-985 (2012).
- Barron, D. H., Matthews, B. H. The interpretation of potential changes in the spinal cord. J. Physiol. 92, 276-321 (1938).
- Schmidt, R. F., Trautwein, W., Zimmermann, M. Dorsal root potentials evoked by natural stimulation of cutaneous afferents. Nature. 212, 522-523 (1966).
- Eccles, J. C., Schmidt, R. F., Willis, W. D. Presynaptic inhibition of the spinal monosynaptic reflex pathway. J. Physiol. 161, 282-297 (1962).
- Manjarrez, E., Rojas-Piloni, J. G., Jimenez, I., Rudomin, P. Modulation of synaptic transmission from segmental afferents by spontaneous activity of dorsal horn spinal neurones in the cat. J. Physiol. 529 Pt 2, 445-460 (2000).
- Geis, C., et al. Human Stiff-Person Syndrome IgG Induces Anxious Behavior in Rats. PLoS One. 6, e16775 (2011).
- Martinez-Gomez, J., Lopez-Garcia, J. A. Electrophysiological and pharmacological characterisation of ascending anterolateral axons in the in vitro mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 146, 84-90 (2005).
