Summary

Suivi juxtacellulaire et localisation des neurones unique au sein de structures cérébrales sous-corticales d'alerte, Head-Rats retenu

Published: April 27, 2015
doi:

Summary

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Abstract

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal’s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

Introduction

Suivi de l'activité neuronale chez un animal d'alerte activement engagé dans une tâche comportementale est essentiel pour comprendre la fonction et l'organisation du système nerveux. Enregistrement extracellulaire de l'activité électrique des unités neuronales simples a longtemps été un outil de base des systèmes neurosciences et est encore largement en usage à l'heure actuelle. Une variété de types et de configurations électrodes sont disponibles selon les exigences scientifiques et techniques d'une expérience particulière. Chroniquement implanté Microdrive ou réseaux d'électrodes sont souvent utilisés chez les animaux se déplacent librement, y compris les oiseaux, les rongeurs et les primates non humains 1-4. Alternativement, pénétrations aigus avec métal ou en verre microélectrodes via un micromanipulateur externe sont souvent utilisés pour enregistrer à partir d'animaux anesthésiés ou tête-retenu. Verre électrodes de micropipette ont l'avantage qu'ils peuvent être utilisés dans la juxtacellulaire ou "cellule attachés" configuration à isoler sans ambiguïté laactivité de neurones individuels sans les complications de pic post-hoc de tri 5. Ces électrodes permettent en outre l'enregistrement à partir de cellules ou les emplacements identifiés anatomiquement, car ils peuvent être utilisés pour injecter des petits dépôts de colorants traceurs ou neuro-anatomiques, ou même de remplir la cellule individuelle enregistrée. Cette configuration a été appliquée avec succès dans les rats, les souris et les oiseaux 6-10. La technique décrite ici se concentre sur le suivi juxtacellulaire et des dépôts de colorant extracellulaires en alerte, les rats de tête-retenu. Notez que contrairement à cellule unique juxtacellulaire remplit, ces dépôts de colorants ne fournissent pas d'informations sur la morphologie cellulaire ou projections axonales 11, mais ils permettront localisation anatomique exacte à environ 50 um et, surtout, avoir un rendement significativement plus élevé chez les animaux d'alerte. Les informations concernant une seule cellule remplit juxtacellulaire est néanmoins fourni comme une stratégie alternative pour l'étiquetage anatomique.

En bref, leprotocole se compose de trois grandes phases. Dans la première phase, le rat est acclimaté à la retenue du corps dans une chaussette de tissu (Figure 1) sur une période de 6 jours. Dans la deuxième phase, un dispositif de retenue de la tête (Figure 2) et la chambre d'enregistrement sont implantés chirurgicalement tels que le rat peut être maintenue dans le plan stéréotaxique au cours de plusieurs sessions d'enregistrement suivantes (figure 3); cette procédure permet à l'expérimentateur de cibler des régions sous-corticales du cerveau pour l'étude électrophysiologique basée sur coordonne référence standard 12. La troisième phase consiste à placer le rat dans un gabarit approprié pour effectuer les expériences comportementales et électrophysiologiques (figure 4), la construction de l'électrode à partir d'un tube capillaire en quartz (Figure 5), la réalisation d'enregistrements de neurones qui isolent juxtacellulaire sans ambiguïté les unités individuelles 6-9, et marquant les Locati anatomiquessur le site d'enregistrement avec Chicago Sky colorant bleu (figures 6 et 7). Les enregistrements ont été effectués avec la surveillance comportementale simultanée; Cependant, les détails techniques du comportement dépendront des objectifs scientifiques de chaque expérience et sont donc au-delà de la portée d'un protocole unique. Après achèvement de la procédure expérimentale, qui peut être répétée sur plusieurs jours, l'animal est euthanasie. Le cerveau est extrait et traitées selon la norme neuroanatomiques techniques utilisant soit lumineux champ ou microscopie à fluorescence.

Protocol

Les protocoles expérimentaux ont été réalisés sur des rats femelles Long Evans (250-350 g) conformément aux soins des animaux et de l'utilisation des lignes directrices prescrites par le fédéral et ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle à l'Université de Californie à San Diego. 1. Acclimatation Rat Body retenue REMARQUE: Placez le rat sur un régime restreint. Nourrir le rat une fois pa…

Representative Results

Unités neuronales dans ventrale médiale postérieure (VPM) du thalamus encodage la phase de mouvement de vibrisses pendant l'auto-généré fouettant 15,16. Figure 7A montre échantillon activité de dopage d'une unité thalamique VPM comme un rat est fouettant activement. Figure 7B montre un histogramme de pic fois alignées sur la phase instantanée du mouvement vibrisses 17. Il ya plus de pointes pendant la phase de rétraction de fouettant. Apr?…

Discussion

Construction du gabarit expérimentale

La description des éléments mécaniques utilisés pour construire le gabarit expérimental (figure 4) est omis dans le protocole, car il peut être construit de différentes manières. Dans la présente norme de démonstration opto-mécanique pièces et colliers de fixation sont utilisés pour monter la barre d'appuie-tête et le tube de retenue de corps (voir la section des matériaux).</str…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful to the Canadian Institutes of Health Research (grant MT-5877), the National Institutes of Health (grants NS058668 and NS066664), and the US-Israeli Binational Foundation (grant 2003222) for funding these studies.

Materials

Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments 
Ketaset (Ketamine HCl) Fort Dodge  N/A
Anased (Xylazine solution) Lloyd Laboratories N/A
Betadyne (Povidone-Iodine) CVS Pharmacy 269281
Loctite 495 Grainger Industrial Supply 4KL86 20-40 cp cyanoacrylate
Vetbond 3M 1469SB
Grip cement powder Dentsply Intl 675571 For the base of the recording chamber
Grip cement liquid Dentsply Intl 675572 For the base of the recording chamber
Silicone Gel Dow Corning Mar-80
Jet denture repair acrylic powder Lang Dental Manufacturing Co. N/A For securing the head restraint apparatus to the cranium
Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid Lang Dental Manufacturing Co. N/A For securing the head restraint apparatus to the cranium
Chicago sky blue Sigma C8679
Paraformaldehyde Sigma 158127 For perfusion and tissue fixation
Phosphate-buffered saline Sigma P3813 For perfusion and tissue fixation
Cytochrome C Sigma C2506 For cytochrome-oxidase staining (Figure 7)
Diaminobenzidine Sigma D5905 For cytochrome-oxidase staining (Figure 7)
Material Name Company Catalogue Number Comments 
Rat sock Sew Elegant (San Diego, CA) N/A Custom made, Figures 1, 4
PVC tube 2 ½” U.S. Plastic Co. 34108 Figure 4
Subminiature D pins & sockets TE Connectivity 205089-1 Figure 3
Stainless steel music wire 0.010” diameter Precision Brand Products, Inc. 21010 Figure 3
Stereotaxic holding frame Kopf Instruments Model 900 Figure 3
Stereotaxic ear bars Kopf Instruments Model 957 Figure 3
Stereotaxic manipulator Kopf Instruments Model 960 Figure 3
½ mm drill burr Henry Schein 100-3995
Quiet-Air dental drill  Midwest Dental 393-1600
Stainless steel 0-80 1/8” screw Fastener superstore 247438 Figure 3
0.2mL centrifuge tube Fisher Scientific 05-407-8A Figure 3
Custom head-holding bar UCSD SIO Machine Shop N/A Custom made, Figures 2, 3, 4
Custom head-holding plate UCSD SIO Machine Shop N/A Custom made, Figure 2, 3, 4
Right angle post-clamp Newport MCA-1 Figure 3,4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp.
8-32 3/4” screw Fastener Superstore 240181 For head-restraint, Figure 3
4-40 ¼” screw Fastener Superstore 239958 For head restraint, Figures 3, 4
Quartz capillary tubing Sutter Instruments QF-100-60-10 Figure 5
Carbon dioxide laser puller Sutter instruments P-2000
Motorized micromanipulator Sutter Instruments MP-285
Microelectrode amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A
Microelectrode amplifier head stage Molecular Devices CV-7B Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A 
Isolated pulse stimulator A-M Systems Model 2100 Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A
Audio monitor Radio Shack 32-2040
Pipette holder Warner Instruments #MEW-F10T Alternate parts: see Discussion
Figure 6A
Electrode lead wire Cooner wire NEF34-1646 (optional), Figure 6D
Relay for amplifier head-stage COTO Technology #2342-05-000 (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C
Digital video camera Basler A602fm (optional) For behavioral monitoring, Figure 7

References

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Cite This Article
Moore, J. D., Deschênes, M., Kleinfeld, D. Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats. J. Vis. Exp. (98), e51453, doi:10.3791/51453 (2015).

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