Summary

Lineage-Umprogrammierung der Perizyten-abgeleiteten Zellen des erwachsenen menschlichen Gehirn in Neuronen induziert

Published: May 12, 2014
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Summary

Gehirn-Targeting-residente Zellen für die direkte Abstammungslinie Neuprogrammierung bietet neue Perspektiven für die Gehirn-Reparatur. Hier beschreiben wir ein Protokoll, wie die Kulturen für Gehirn-Resident Perizyten aus erwachsenen menschlichen Gehirnrinde angereichert vorzubereiten und wandeln diese in induzierten Neuronen durch Retrovirus-vermittelte Expression der Transkriptionsfaktoren und Sox2 ASCL1.

Abstract

Direkte Linie-Reprogrammierung von nicht-neuronalen Zellen in Neuronen induziert (INS) kann Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Neurogenese bieten und ermöglichen neue Strategien für In-vitro-Modellierung oder die Reparatur des kranken Gehirns. Identifizieren Gehirn-Resident nicht-neuronalen Zelltypen zugänglich direkte Umwandlung in iNs könnte für die Einführung eines solchen Ansatzes in situ, dh innerhalb des geschädigten Hirngewebe zu ermöglichen. Hier beschreiben wir eine in dem Versuch der Identifikation von Zellen aus erwachsenen menschlichen Gehirn, die diese Prämisse zu erfüllen abgeleitet entwickeltes Protokoll. Dieses Protokoll umfasst: (1) die Kultivierung von menschlichen Zellen aus der Hirnrinde von erwachsenen menschlichen Gehirn Biopsien erhalten; (2) die in vitro-Vermehrung (etwa 2-4 Wochen erforderlich) und die Charakterisierung der Kultur durch Immunzytochemie und Durchflusszytometrie; (3) die Anreicherung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) unter Verwendung von Anti-PDGF-β-Rezeptor-und Anti-CD146-Antikörper;(4) die Retrovirus-vermittelte Transduktion mit dem neurogene Transkriptionsfaktoren Sox2 und ASCL1; (5) und schließlich die Charakterisierung der resultierenden pericyte abgeleiteten induzierten Neuronen (PdiNs) durch Immunzytochemie (14 Tage bis 8 Wochen nach retroviraler Transduktion). In diesem Stadium kann ins für ihre elektrischen Eigenschaften von Patch-Clamp-Aufnahme untersucht werden. Dieses Protokoll stellt eine hoch reproduzierbares Verfahren für die in vitro-Umwandlung der Linie Gehirnfremden Perizyten in funktionelle menschliche INS.

Introduction

Um eine Anpassung an somatischen Zellen zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), die wiederum mit einer Vielzahl von Differenzierungspotentiale gegen ausgestattet zielt direkte Anpassung für gerade Umwandlung eines spezifischen Zelltyp in einen anderen. Mit Bezug auf ihre Anwendung im Rahmen der Seuchenmodellierung und potenzielle zellbasierte Therapien, haben beide Ansätze Umprogrammierung spezifischen Vor-und Nachteile. Umprogrammieren in iPS-Zellen (i) bietet eine nahezu unendliche Quelle von Zellen; (Ii) können für die Gentechnik; (Iii) verleiht mit einer nahezu unbegrenzten Differenzierungspotenzial. , Hauptnachteile iPSCs bringen jedoch die Gefahr der Tumorigenität von undifferenzierten Zellen (Teratombildung in vivo) und die Notwendigkeit für die ex vivo Kultivierung und nachfolgende Transplantation, wenn diese Zellen bei Zelltherapien verwendet werden. Umgekehrt wird eine direkte Abstammungslinie Umprogrammierung durch die geringere Ausbeute an den gewünschten Zellen beschränktdie direkt korreliert mit der Anzahl der Zielzellen von der Ausgangspopulation, besitzt den Vorteil, dass linien umgewandelten Zellen scheinen keine tumorerzeugende Risiko bei Transplantation 1,2 aufweisen, aber; Weiterhin direkte Anpassung kann auch in situ, dh innerhalb des Organs, wo würden diese Zellen benötigt werden, wodurch die Notwendigkeit der Transplantation erreicht werden.

In diesem Sinne, unser Labor hat die Möglichkeit der Umprogrammierung-Linie Gehirn-residente Zellen in iNs als neuartiges Konzept für zellbasierte Therapien von neurodegenerativen Erkrankungen verfolgt. Brain-residenten Zellen, die potenziell als zelluläre Ziele für linien Umprogrammierung angesehen werden können, umfassen verschiedene Arten von Makroglia (Astrozyten, Oligodendrozyten und NG2 Zellen), Mikroglia und Mikrogefäß-assoziierten Zellen (Endothelzellen und Perizyten). Wir haben ausführlich die in vitro-Umprogrammierung Potenzial der Astroglia der Hirnrinde untersuchttex der frühen postnatalen Mäusen 3-5. Auf der Suche nach ähnlich geeigneten Zellquellen für die direkte Abstammungslinie Umprogrammierung im erwachsenen menschlichen Gehirn, stießen wir auf eine Zellpopulation, die erfolgreich in Ins und Ausstellungs Markenzeichen der Perizyten neu programmiert werden kann. Hier wir ein Protokoll, wie diese Zellen aus erwachsenen menschlichen Gehirn Biopsien geerntet, zu erweitern und zu bereichern, diese Zellen in vitro und schließlich erfolgreich einen wesentlichen Anteil dieser in vitro expandierten Zellen (im Bereich von 25-30%) in umprogrammieren beschreiben Ins. Umprogrammierung durch gleichzeitige Retrovirus-vermittelte Co-Expression von zwei Transkriptionsfaktoren, Sox2 und ASCL1 erreicht werden. Diese PdiNs wurden gefunden, um die Fähigkeit von sich wiederholenden Aktionspotential Brand zu erwerben und als Ziele für die synaptische anderen Neuronen Angabe ihrer Fähigkeit, die Integration in neuronalen Netzwerken dienen. Unser Protokoll stellt eine einfache Methode zur Isolierung und Abstammung Umwandlung von erwachsenen menschlichen Gehirn Perizyten in Ins. </p>

Protocol

1. Isolierung und Kultivierung von adulten menschlichen Gehirn-Zellen Experimente mit menschlichem Gewebe sollte in Übereinstimmung mit allen relevanten staatlichen und institutionellen Regelungen bezüglich der Verwendung von Menschenmaterial zu Forschungszwecken durchgeführt werden. Die vorliegende Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Genehmigung durch die Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der LMU München und eine schriftliche Einverständniserklärung von allen Patienten…

Representative Results

Das erste Ergebnis dieses Protokoll nach dem erfolgreichen Aufbau einer Kultur aus einer Probe des erwachsenen Menschen Hirnrinde besteht in der Identifizierung der zellulären Zusammensetzung des Kultur. Immunzytochemie für die Zelltyp-spezifische Proteine ​​offenbart eine beträchtliche Heterogenität zwischen den Kulturen Probe verschiedener Patienten (1A) abgeleitet ist. Wie durch die Strömungs Durchflusszytometrie quantifiziert gibt es immer eine wesentliche Fraktion von Zellen, PDGFRβ expri…

Discussion

Das vorliegende Protokoll beschreibt die in-vitro-Erweiterung und Bereicherung des pericyte-abgeleiteten Zellen nach der Isolierung von adulten menschlichen Großhirnrinde und die anschließende Umwandlung in Ins, die von Retrovirus-vermittelte Expression von Transkriptionsfaktoren der neurogenen Sox2 und ASCL1. Solche Protokoll bietet eine experimentelle in vitro-System, die Linie-Umwandlung von Gehirn-residente Zellen in Neuronen und Glia potenziell auch zu untersuchen, mit dem Ziel vor Augen, um sch…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Magdalena Götz für ihre Eingabe während der Entwicklung dieses Protokolls. Wir danken Dr. Marius Wernig (Stanford University) für die großzügige Bereitstellung von uns mit der Sox2 kodierenden Sequenz. Wir sind auch sehr dankbar, dass Dr. Alexandra Lepier für die Virusproduktion. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) und dem BMBF (01GN1009A) an BB, und dem Bayerischen Staatsministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst zu MK und BBCS erhielt Mittel aus dem binationalen SYSTHER unterstützten INREMOS Virtuelle Institute (Deutsch und Slowenisch Bundesministerien für Bildung und Forschung) und der DFG (SFB 824).

Materials

anti-CD140b-PE BD Biosciences 558821 use 1:100
anti-CD146-FITC AbD Serotec MCA2141FT use 1:100
anti-CD13-FITC AbD Serotec MVA1270A488T use 1:100
anti-CD34-APC BD Biosciences 560940 use 1:100
anti-PDGFRβ Cell Signaling 3169S use 1:200
anti-CD146 Abcam Ab75769 use 1:400
anti-NG2 Millipore AB5320 use 1:400
anti-SMA Sigma-Aldrich A2547 use 1:400
anti-βIII-tubulin Sigma-Aldrich T8660 use 1:400
anti-MAP2 Sigma-Aldrich M4403 use 1:200
anti-GFAP Sigma-Aldrich G3893 use 1:600
anti-GFP Aves Labs GFP 10-20 use 1:1000
anti-RFP Chromotek 5F8 use 1:500
anti-S100β Sigma-Aldrich S2532 use 1:300
anti-NeuN Millipore MAB377 use 1:200
anti-GABA Sigma-Aldrich A2052 use 1:500
anti-Calretinin Millipore AB5054 use 1:500
anti-vGluT1 SYnaptic SYstems 135511 use 1:1000
Rat IgG1 isotype control FITC AbD Serotec 11-4301-81 use 1:100
Rat IgG1 isotype control PE AbD Serotec 12-4301-81 use 1:100
Rat IgG1 isotype control APC AbD Serotec 17-4301-81 use 1:100
TrypLE Invitrogen 12605-010
DMEM, high glucose, GlutaMAX Invitrogen 61965
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504044
fetal calf serum Invitrogen 10106-169 perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) Invitrogen 24020-091
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) Invitrogen 14190
HEPES  Sigma-Aldrich H3375
Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) Sigma-Aldrich P0899
PFA (paraformaldehyde) Sigma-Aldrich P1648
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate Sigma-Aldrich 042M4005
Aqua-Poly/Mount Polysciences 18606-20
Polypropylene round-bottom tubes  BD Biosciences 352063
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap  BD Biosciences 352235
24-well plates Orange Scientific 5530305
75 cm2 culture flasks Greiner Bio-One 658175
25 cm2 culture flasks Greiner Bio-One 690175
Disposable pipettes 10 ml Sarstedt #########
Glass Pasteur pipettes (150 mm) Fisherbrand FB50251
Glass coverslips 12 mm diameter Menzel CB00120RA1
Surgical disposable scalpels  B. Braun 5518083
Tissue culture dishes  Greiner Bio-One 633180
Conical tubes 15ml BD Biosciences 352095
Laminar flow hood
Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes Hettich Lab Technology 1406
Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software  BD Biosciences
Humified cell culture incubator Eppendorf Galaxy 170R
Wather bath at 37 °C
FACSFlow sheath fluid  BD Biosciences 342003
Epifluorescence microscope BX61 Olympus
Confocal microscope LSM710 Zeiss

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Cite This Article
Karow, M., Schichor, C., Beckervordersandforth, R., Berninger, B. Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons. J. Vis. Exp. (87), e51433, doi:10.3791/51433 (2014).

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