用RNAscope<em>その場で</em>ヘッドの転写的に活性なヒトパピローマウイルスの検出および頸部扁平上皮癌

1。サンプル、機器、試薬の調製室温（25℃）で16から32時間、新鮮な10％​​中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込んで、厚さが3〜4程度のブロックに組織標本をカット。 FFPEブロックから5±1μmの厚さのセクションにFFPEをカットし、スライドや空気乾燥に関するセクションをマウントします。注：スライドは最大3ヶ月間乾燥下、室温で保存することができる。マウント組織スライドの前RNAscopeアッセイを1時間にわたって60℃で乾燥した状態でベーキング処理をお願いします。 40℃へのハイブリダイゼーションオーブンをもたらす湿度制御トレイに加湿紙を置きます。それを完全に濡らすために加湿紙に50ミリリットルのdH 2 Oを追加します。使用前に少なくとも30分間予熱し、オーブンに覆われたトレイを挿入します。 のdH 2 Oに10倍の前処理溶液を希釈して700ミリリットル1X前処理2溶液（10 NL、pHが6クエン酸緩衝液）を作る沸騰し1X前処理2ソリューションを加熱し、舞過沸騰防止しながら100-104℃の間の温度ntain。 のdH 2 Oに予め温め50X洗浄バッファーを希釈することにより、3 L 1X洗浄バッファー（0.1×SSC）を作るヒュームフードの下で脱パラフィンキシレンの2×200ミリリットル、100％エタノールで2回200ミリリットルを用意します。 ヒュームフードの下でポスト染色に50％ヘマトキシリン​​染色液とブルーイング試薬（0.01％アンモニア水）を準備します。 ヒュームフードの下に脱水キシレン200ミリリットル、200ミリリットルの70％、および2×200ミリリットル100％エタノールを準備します。 10分間40℃で予熱し標的プローブおよびRTU Amp1と、Amp2の、増幅器（Error Amp3）、AMP4、アンプ5 – ブラウン、およびAMP6ブラウンを含め、室温にRTU検出キットの試薬をもたらす、DAB発色ブラウン-Aとブラウン-Bを除く。 2。 RNAscopeアッセイ脱パラフィンおよび脱水焼成後、頻繁に攪拌しながら、2×5分間、キシレン中で組織切片を脱パラフィンし、脱水頻繁に撹拌しながら、2×3分間の100％EtOH中。空気が5分間乾燥し、疎水性バリアペンで組織切片の周囲に疎水性のバリアを描く。 前処理のdH 2 Oにすすぎ、内因性ペルオキシダーゼ活性のクエンチングをRTで10分間前処理1で組織切片をインキュベートをdH 2 Oで二回すすぎ、RNA検索のための15分間沸騰温度に維持前処理2で組織切片をインキュベート HybEZオーブン内タンパク質消化のために40°Cで30分間前処理3で組織切片をインキュベートし、をdH 2 Oで二回すすぎターゲットプローブハイブリダイゼーション標的プローブのHPV-HR 7プールが含まれます：HPV16、18、31、33、35、52、および58を。 3隣接組織切片上に別途のHPVプローブ、ユビキチンC（UBC）と細菌の遺伝子のdapBプローブを追加します。 2オーブンで40℃でハイブリダイズHRは、次いで室温で2×2分間1X洗浄緩衝液中ですすいでください。 シグナル増幅 15分間、40°C、40°Cで30分間増幅器（Error Amp3）（アンプ）、及びAMP4（標識プローブ）で15分間、40°C、Amp2の （バックグラウンド低減）で30分間Amp1と （前置増幅器）を用いて組織切片をインキュベートHybEZオーブンで40℃で。各ハイブリダイゼーション工程の後、RTで2×2分間、1×洗浄緩衝液でリンスする。 RTで15分間、30分間、AMP5およびAMP6で組織切片をインキュベートする。各インキュベーション工程の後、RTで2×2分間、1×洗浄緩衝液でリンスする。 信号検出 RTで10分間ブラウン-Aとブラウン-Bの等量混合DAB 1:1混合物で組織切片をインキュベートし、をdH 2 Oで二回すすぎ対比染色<p組織は紫のままスライドが明確になるまで、クラス= "jove_content">室温で2分間50％ヘマトキシリン溶液で染色組織切片は、D.H. 2 Oですすいでください。ディップは5倍ののdH 2 O中0.01％のアンモニアにスライドとDH 2 O中5ディップで追跡スライド取り付け 2分毎に70％、100％、および100％EtOH中で組織切片を脱水し、キシレンで5分間、キシレン系封入剤でマウントする。