RNAscope für<em> In situ</em> Erkennung von transkriptionell aktiven Human Papillomavirus in Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom
Summary
Das Vorhandensein von Hochrisiko-HPV im Kopf-und Halstumorgewebe ist mit den positiven Ergebnissen assoziiert. Die neu entwickelte RNA in situ Hybridisierung Technik namens RNAscope ermöglicht die direkte Visualisierung von HPV E6/E7 mRNA in FFPE-Gewebeschnitten.
Abstract
Der "Goldstandard" für die onkogenen HPV-Nachweis ist die Demonstration von transkriptionell aktiven Hochrisiko-HPV im Tumorgewebe. , Erkennung von E6/E7 mRNA durch quantitative Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) erfordert jedoch die RNA-Extraktion, die das Tumorgewebe Kontext entscheidend für morphologische Korrelation zerstört und war schwierig, in der klinischen Routine verabschiedet werden. Unsere neu entwickelte RNA in situ Hybridisierung Technologie RNAscope, ermöglicht die direkte Visualisierung von RNA in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe mit Einzelmolekülempfindlichkeit und Einzelzellauflösung, die hochsensitive und spezifische in situ-Analyse der RNA Biomarker ermöglicht in der klinischen Routineproben. Die RNAscope HPV-Test wurde entwickelt, um die E6/E7 mRNA von sieben Hochrisiko-HPV-Genotypen (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 und 58) mit einem Pool von Genotyp-spezifischen Sonden zu detektieren. Es hat eine ausgezeichnete Empfindlichkeit nachgewiesenund Spezifität gegen den Strom "Goldstandard" Verfahren zum Nachweis E6/E7-mRNA durch qRT-PCR. HPV-Status von RNAscope bestimmt ist stark prognos den klinischen Verlauf von Mundrachenkrebs-Patienten.
Introduction
Hochrisiko-humanen Papillomviren (HR-HPV) macht etwa 5% aller Krebserkrankungen weltweit ein. Die Häufigkeit von HPV-assoziierten oropharyngealen Krebs hat sich in den letzten Jahrzehnten vor allem bei Männern erhöht. HPV-positive Mund-Rachen-Plattenepithelkarzinom (OPSCC) wird wahrscheinlich bilden eine Mehrheit aller Kopf-und Halskrebs in den USA in den nächsten 20 Jahren 2. Oropharyngeale Plattenepithelkarzinome, die durch HPV verursacht werden, mit günstigen Überleben und Tumor HPV-Status ist ein starker und unabhängiger prognostischer Faktor für das Überleben 3.
Beweise für die transkriptionelle Aktivierung der viralen Onkogene E6 und E7 wird als Goldstandard für die Anwesenheit von klinisch relevanten HPV 4 betrachtet. Allerdings ist der Nachweis E6/E7-mRNA aus frischem Tumorgewebe mittels RT-PCR-Technik nicht praktisch in der klinischen Routine und hat zu den Forschungslabors beschränkt. Vor kurzem haben wir have eine neuartige Technologie namens RNA-ISH RNAscope, die Multiplex-Nachweis mit RNA-Einzelmolekülempfindlichkeit in Formalin fixiert Paraffin eingebettete Gewebeproben (FFPE) 5-10 können in einzelnen Zellen. Wir stellten drei Beweislinien für Einzelmoleküldetektion 5. Erstens erlaubt die RNAscope Sondendesign und Signalverstärkungssystem Detektion von einzelnen Kopie HER2 genomischen DNA-Ziele in HeLa-und SK-BR-3-Zelllinien. Zweitens, wenn genomische DNA mit HER2 Signalen verglichen, die Verteilung der Fluoreszenzintensitäten von HER2-mRNA Signal Punkte in HeLa-Zellen war konsistent mit einem Molekül pro Punkt. Drittens, die Anzahl der HER2-mRNA-Signal Punkte pro Zelle eng aufeinander abgestimmt die durch eine lösungsbasierte Quantifizierung Assay geschätzt HER2-mRNA-Kopienzahl, weitere Stützeinzelmoleküldetektion. Außerdem Gegenfärbung der Zellkerne mit DAPI in der Fluoreszenzmikroskopie oder mit Hämatoxylin in Hellfeld-Mikroskopie ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Kerne, whICH wiederum ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung von RNA-Zielen auf einer Einzelzellgrundlage 10. Die Fähigkeit, die Genexpression in situ in der klinischen Routineproben analysieren RNAscope macht eine vielversprechende Plattform für diagnostische Pathologie, vor allem diejenigen, FFPE-Gewebeschnitt-basierte Assays 10,11. Wir haben eine RNAscope basierten Assay zum Nachweis HPV E6/E7 mRNA von sieben Hochrisiko-HPV-Genotypen (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 und 58) mit einem Pool von Genotyp-spezifische Sonden entwickelt. Unsere bisherigen Untersuchungen haben gezeigt, dass OPSCC die RNAscope HPV Assay ist hochempfindlich und spezifisch bei der Bestimmung HPV-Status auf FFPE-Geweben 12-17 und informiert auch Prognose OPSCC 12,16.
Das Prinzip der RNAscope Technik bereits beschrieben worden 5. Hier beschreiben wir die komplette RNAscope Testprotokoll und zeigen ihre Verwendung in der Detektion von HR-HPV in FFPE-Tumorgewebeschnitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der HPV-Test RNAscope erlaubt die direkte Visualisierung von E6/E7 mRNA in situ in HPV-assoziierte Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom. Die RNAscope Assay ist kompatibel mit routine festen Tumorgewebe und bewahrt Gewebemorphologie für histopathologische Korrelationen (Abbildung 2). Ein wesentlicher Vorteil des Assays über RNAscope CISH herkömmlichen Verfahren ist, dass er spezifisch verstärkt die Hybridisierungssignale (Fig. 2B und 2E) ohne Verstärkung des Hintergrundrauschens (2C und 2F).
In der Praxis kann die RNAscope HPV-Testverfahren innerhalb von 8 Stunden abgeschlossen oder bequem über zwei Tage aufgeteilt werden. Der HPV-Test RNAscope wurde genutzt, um HPV-Status in Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom 12-16 bestimmen, was zeigt, 97% Sensitivität und 93% Spezifität mittels qRT-PCR als Referenzmethode 16. Konventionelle chromogenic ISH für HR-HPV-DNA ist hochspezifisch, sondern hat eine Empfindlichkeit von 12 ~ 80%. Immunhistochemischen (IHC) Färbung für die zelluläre Surrogatmarker p16 zeigt hervorragende Empfindlichkeit, aber können falsche positive Ergebnisse 15,18, vor allem in nonoropharyngeal Kopf-Hals-Tumoren 15 zu generieren. Die aktuelle "Goldstandard"-Methode der qRT-PCR für HPV E6/E7 mRNA-Nachweis erfordert frisch gefrorenem Gewebe für optimale Ergebnisse und ist technisch komplex, was seine Verwendung zu Forschungslabor begrenzt. Darüber hinaus erfordert es die RNA-Extraktion, die es unmöglich macht, HR-HPV E6/E7 mRNA-Expression mit Histopathologie korreliert ist.
Es gibt mehrere kritische Faktoren für den Erfolg der RNAscope Assay. Erstens, um die besten Ergebnisse, Gewebe sind in frischen 10% neutral gepuffertem Formalin bei Raumtemperatur für 16-32 Stunden nach ASCO / CAP 19 Leitlinien festgelegt werden. Zweitens wird der Ofen HybEZ empfohlen, da es zu ermöglichens eine optimale Steuerung der Temperatur und Feuchtigkeit für Sondenhybridisierung und Signalverstärkungsschritten. Drittens ist es wichtig, um überschüssige Rest Puffer vor jedem Schritt zu entfernen, aber immer noch den Gewebeschnitt zu halten vor dem Austrocknen während einer dieser Schritte.
Die hier beschriebene manuelle Verfahren RNAscope wurde vollständig auf einem kommerziellen Auto-Schieber-Färbung System 10 automatisiert. Dies sollte erheblich erleichtern Standardisierung der Testbedingungen und spart wertvolle Handarbeit in der klinischen Pathologie-Laboratorien. Darüber hinaus hat dedizierte Bildanalyse-Software entwickelt, um die Zellen 10 und Färbung Signale auf einer digitalisierten Rutsche, die helfen sollen, die Subjektivität eliminieren und die Reproduzierbarkeit verbessern in Scoring automatisch zu identifizieren.
Zusammenfassend erkennt der HPV-Test RNAscope das Vorhandensein von HR-HPV E6/E7 mRNA-Transkripte in situ in FFPE-Gewebe. Es verfügt über einen Workflow, der vertraut klinischen Pathologie Labor istTories durch Genehmigung der Visualisierung direkt von diesen in Gewebeschnitten. Es bietet eine ideale Plattform für die Prüfung (FFPE) Gewebeproben und kann leicht durch diagnostische Pathologie-Laboratorien angenommen werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützte Teil durch NIH (R43/44CA122444) und DOD BRCP Zuschuss (W81XWH-06-1 bis 0682), um YL.
Materials
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit – Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Cover Glass 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| Drying Oven | Capable of holding temperature at 60 ± 1°C | ||
| Water Bath | Capable of holding temperature at 40 ± 1°C | ||
References
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