RNAscope ل<em> في الوضع الطبيعي</em> الكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري بالموقع Transcriptionally في الرأس والرقبة سرطان الخلايا الحرشفية
Summary
ويرتبط وجود فيروس الورم الحليمي البشري المعرضة للخطر في الرأس والرقبة نسيج الورم مع تحقيق نتائج طيبة. الحمض النووي الريبي وضعت مؤخرا تقنية التهجين في الموقع يسمى RNAscope يسمح التصور المباشر لفيروس الورم الحليمي البشري E6/E7 مرنا في أقسام الأنسجة FFPE.
Abstract
"المعيار الذهبي" للكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري أنكجنيك هو مظاهرة النشطة transcriptionally فيروس الورم الحليمي البشري المعرضة للخطر في أنسجة الورم. ومع ذلك، والكشف عن E6/E7 مرنا بواسطة الكمي عكس النسخ بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (QRT-PCR) يتطلب استخراج الحمض النووي الريبي الذي يدمر سياق نسيج الورم حاسم لعلاقة شكلية وكان من الصعب أن تعتمد في الممارسة السريرية الروتينية. لدينا الحمض النووي الريبي وضعت مؤخرا التكنولوجيا الموقع التهجين، RNAscope في، يسمح التصور المباشر من الحمض النووي الريبي في الفورمالين الثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) مع حساسية الأنسجة جزيء واحد وقرار وحيد الخلية، والتي تمكن حساسة للغاية ومحددة تحليل الوضع الطبيعي في أي الحمض النووي الريبي في العلامات البيولوجية في العينات السريرية الروتينية. تم تصميم RNAscope فيروس الورم الحليمي البشري فحص للكشف عن E6/E7 مرنا من سبعة عالية المخاطر فيروس الورم الحليمي البشري المورثات (HPV16، 18، 31، 33، 35، 52، و 58) باستخدام مجموعة من تحقيقات النمط الجيني محددة. وقد أثبتت أنها حساسية ممتازةوالتحديد ضد الطريقة الحالية "المعيار الذهبي" للكشف عن E6/E7 مرنا بواسطة QRT-PCR. حالة فيروس الورم الحليمي البشري التي تحددها RNAscope هو النذير بشدة من النتائج السريرية لدى مرضى سرطان الفم والبلعوم.
Introduction
حسابات فيروس الورم الحليمي البشري المعرضة للخطر (HR-HPV) إصابة ما يقرب من 5٪ من جميع حالات السرطان في جميع أنحاء العالم 1. وزادت حالات الإصابة بسرطان الفم والبلعوم المرتبط فيروس الورم الحليمي البشري خلال العقود الماضية، وخاصة بين الرجال. والفم والبلعوم وسرطان الخلايا الحرشفية، فيروس الورم الحليمي البشري الإيجابية (OPSCC) تشكل أغلبية الأرجح من جميع سرطانات الرأس والعنق في الولايات المتحدة في 20 سنوات القادمة 2. وترتبط الفم والبلعوم سرطان الخلايا الحرشفية الناجمة عن فيروس الورم الحليمي البشري مع بقاء مواتية، وحالة الورم فيروس الورم الحليمي البشري هو عامل النذير قوية ومستقلة من أجل البقاء 3.
ويعتبر الدليل على تفعيل النسخي من الجينات المسرطنة الفيروسي E6 E7 وكمعيار الذهب لوجود فيروس الورم الحليمي البشري ذات الصلة سريريا 4. ومع ذلك، والكشف عن E6/E7 مرنا من أنسجة الورم الطازجة بواسطة تقنية RT-PCR ليس من العملي في الممارسة السريرية الروتينية، وقد تقتصر على مختبرات الأبحاث. في الآونة الأخيرة، ونحن هفوضعت ه رواية تكنولوجيا الحمض النووي الريبي ISH دعا RNAscope، والتي تمكن الكشف متعددة في الخلايا الفردية مع واحدة RNA حساسية جزيء في الفورمالين الثابتة عينات الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) 5-10. قدمنا ثلاثة خطوط من الأدلة لكشف جزيء واحد 5. الأول، وتصميم وإشارة RNAscope التحقيق نظام التضخيم يسمح الكشف عن نسخة واحدة HER2 أهداف الحمض النووي الجيني في هيلا وSK-BR-3 خطوط الخلايا. الثاني، بالمقارنة مع HER2 إشارات الحمض النووي الجيني، وكان توزيع شدة الفلورسنت من النقاط إشارة HER2 مرنا في خلايا هيلا يتفق مع جزيء واحد لكل نقطة. ثالثا، عدد HER2 مرنا النقاط إشارة لكل خلية المتطابقة عن كثب في عدد النسخ HER2 مرنا قدر من قبل مقايسة الكمي القائم على الحل، مما يدعم الكشف عن جزيء واحد. علاوة على ذلك، counterstaining من نوى مع دابي في المجهر الفلورسنت أو مع الهيماتوكسيلين في المجهر مشرق الميدان يسمح التصور من النوى الفردية، ذوي الخوذات البيضاءمعنوى بدوره يسمح الكشف النوعي والكمي لأهداف RNA على أساس وحيدة الخلية 10. القدرة على تحليل التعبير الجيني في الموقع في العينات السريرية الروتينية يجعل RNAscope منصة واعدة لأمراض التشخيص، وخاصة تلك المستندة إلى قسم المقايسات الأنسجة FFPE 10،11. قمنا بتطوير فيروس الورم الحليمي البشري مقايسة على أساس RNAscope للكشف عن E6/E7 مرنا من سبعة أنماط جينية عالية الخطورة فيروس الورم الحليمي البشري (HPV16، 18، 31، 33، 35، 52، و 58) باستخدام مجموعة من تحقيقات النمط الجيني محددة. وقد أظهرت الدراسات الحديثة لدينا في OPSCC أن RNAscope فيروس الورم الحليمي البشري فحص حساس للغاية ومحددة في تحديد حالة فيروس الورم الحليمي البشري على أنسجة FFPE 12-17، وأيضا بإعلام التكهن في OPSCC 12،16.
مبدأ التكنولوجيا RNAscope وقد وصفت سابقا 5. هنا، نحن تصف كاملة بروتوكول RNAscope فحص وتثبت استخدامه في الكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري في HR-FFPE الورم أقسام الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفيروس الورم الحليمي البشري RNAscope مقايسة يسمح التصور المباشر من E6/E7 مرنا في الموقع في فيروس الورم الحليمي البشري المرتبطة الرأس والرقبة وسرطان الخلايا الحرشفية. مقايسة RNAscope متوافقة تماما مع أنسجة الورم بشكل روتيني ثابت ويحافظ على مورفولوجيا الأنسجة لالارتباطات التشريحية المرضية (الشكل 2). والميزة الرئيسية للمقايسة RNAscope على الطرق التقليدية CISH هو أنه يزيد على وجه التحديد إشارات التهجين (أرقام 2B و2E) دون تضخيم الضوضاء في الخلفية (أرقام 2C و2F).
في الممارسة العملية، ويمكن الانتهاء من إجراءات الفحص RNAscope فيروس الورم الحليمي البشري في غضون 8 ساعة أو مريح تنقسم على مدى يومين. وقد استخدم RNAscope فيروس الورم الحليمي البشري فحص لتحديد حالة فيروس الورم الحليمي البشري في الرأس والرقبة وسرطان الخلايا الحرشفية 12-16، مما يدل على حساسية 97٪ و 93٪ خصوصية باستخدام QRT-PCR كطريقة مرجع 16. مركز حقوق الإنسان التقليديةISH omogenic لHR-فيروس الورم الحليمي البشري الحمض النووي هو محددة للغاية ولكن لديه حساسية ~ 80٪ 12. المناعى (IHC) لتلطيخ الخلوية بديلة علامة P16 يوضح حساسية ممتازة ولكن قد يولد نتائج إيجابية كاذبة 15،18، وخاصة في nonoropharyngeal سرطانات الرأس والعنق 15. "المعيار الذهبي" الطريقة الحالية لQRT-PCR لفيروس الورم الحليمي البشري E6/E7 مرنا يتطلب الكشف الأنسجة الطازجة المجمدة لأفضل النتائج ومعقد من الناحية التقنية، الأمر الذي يحد من استخدامه لمختبر أبحاث فقط. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يتطلب استخراج الحمض النووي الريبي الذي يجعل من المستحيل لربط HR-HPV E6/E7 مرنا التعبير مع التشريح المرضي.
هناك العديد من العوامل الحاسمة لنجاح الفحص RNAscope. الأولى، للحصول على أفضل النتائج، ينبغي أن تكون ثابتة الأنسجة في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة الطازجة في درجة حرارة الغرفة ل16-32 ساعة وفقا لمبادئ توجيهية ASCO / CAP 19. الثاني، ينصح بشدة الفرن HybEZ منذ ذلك تمكينق التحكم الأمثل لدرجة الحرارة والرطوبة لتهجين التحقيق وإشارة الخطوات التضخيم. ثالثا، من المهم أن إزالة مخازن المتبقية الزائدة قبل كل خطوة ولكن لا تزال تبقي على قسم الأنسجة من خلال تجفيف أي من هذه الخطوات.
الإجراء RNAscope دليل الموصوفة هنا تم مؤتمتة بالكامل على شريحة نظام لصناعة السيارات في تلطيخ التجارية 10. وهذا ينبغي أن يسهل إلى حد كبير توحيد شروط الفحص وتوفير العمالة اليدوية الثمينة في مختبرات علم الأمراض السريرية. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير برنامج تحليل الصور مكرسة 10 لتحديد الخلايا وإشارات تلطيخ على شريحة رقمية، والتي ينبغي أن تساعد على التخلص من الذاتية وتحسين استنساخ في التهديف تلقائيا.
باختصار، بالكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري RNAscope فحص وجود محاضر HR-HPV E6/E7 مرنا في الموقع في الأنسجة FFPE. أنه يحتوي على سير العمل التي هي مألوفة لعلم الأمراض السريرية مختبرالمحافظين من خلال السماح التصور مباشرة من هذه الفروع في الأنسجة. أنه يوفر منصة مثالية لدراسة (FFPE) عينات الأنسجة، ويمكن اعتمادها بسهولة من قبل مختبرات علم الأمراض التشخيص.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
معتمدة في جزء من منحة المعاهد الوطنية للصحة (R43/44CA122444) ومنحة وزارة الدفاع BRCP (W81XWH-06-1-0682) لYL.
Materials
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit – Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Cover Glass 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| Drying Oven | Capable of holding temperature at 60 ± 1°C | ||
| Water Bath | Capable of holding temperature at 40 ± 1°C | ||
References
- Parkin, D. M. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002. Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).
- Chaturvedi, A. K., et al. Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States. J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).
- Smeets, S. J., et al. A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen. Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Liu, X., et al. Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity. J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Payne, R. E., et al. Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients. Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).
- Bordeaux, J. M., et al. Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen. PLoS One. 7 (5), (2012).
- Wang, Z., et al. Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma. J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).
- Tubbs, R. R., et al. Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders. Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).
- Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma. Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).
- Lewis, J. S., et al. Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas–a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization. Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).
- Lewis, J. S., et al. Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status. Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).
- Bishop, J. A., et al. Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method. Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Schache AG, ., et al. Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma. Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).
- Mehrad, M., et al. Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus. Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).
- Jordan, R. C., et al. Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials. Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).
