Bio-tabanlı Sanayi Feedstock olarak Tütün Ağacı ve Kavak Değerlendirme transkript ve metabolit profil

1.. Bitki Materyali M2 profesyonel yetiştirme ortamı içeren 30 cm çapında tencere, Nicotiana glauca bitkiler yetiştirin. Gündüz 20-25 ° C sıcaklıkta ve 15 ° C gece sıcaklığı, sera içinde bitkiler büyümeye Ek ışık rejimi gibi bir 16 saat ışık ve 8 saat karanlık döngüsünü kullanın. 2.. Numune Hazırlama Birincil metabolizma için: Hasat bitki materyalleri (yaprak ve N. glauca sapları) ve donma malzeme hemen. Üç gün boyunca dondurma-kurutma ile dondurulmuş bitki materyali liyofilize edilir. Metal topları ile mikser değirmen tarafından liyofilize örnekleri eziyet. 2 ml'lik bir santrifüj tüpü ya da bir cam şişe içine kısım ince öğütülmüş kuru malzemeler. Sekonder metabolitler için: Hasat bitki dokuları ve donma malzeme hemen. M tarafından dondurulmuş bitki dokuları eziyetpaslanmaz çelik top ile veya havanda tarafından ixer değirmen. 2 ml santrifüj tüpüne (yaklaşık 20 mg ıslak ağırlık) içine kısım ince zemin dokuları. GC-MS ile İlköğretim Metabolitlerinden için Metabolizma profilleme için 3. Ekstraksiyon Protokol Tümbölen Zemin kuru bitki materyali (yaprak 10 mg ve kök malzemelerin 20 mg) 2 ml, yuvarlak alt tüpler kapağı vidalı. 10 saniye boyunca% 100 metanol ve vorteks 1400 ul ekleyin. 10 saniye için bir iç standart kantitatif ve girdap gibi ribitol 60 ul (H2O içinde 0.2 mg / ml stok) ilave edin. Bir paslanmaz çelik (veya zirkonyum dioksit) eklenir ve top 25 Hz, 2 dakika boyunca bir karıştırıcı ile Mill materyalini homojenleştirin. X 11000 g, 10 dakika boyunca karışımın santrifüjleyin. Bir cam şişeye süpernatant aktarın. Kloroform ve 750 ul ekleyin. H2O 1500 ul eklenir ve 10 saniye boyunca girdap karışımı. 150 ul transferyeni bir 1.5 ml'lik bir santrifüj tüpüne üst faz (polar faz). Hızlı bir vakum kullanılarak Kuru örnekleri. Bu, herhangi bir artık sıvı, mevcut kadar örnekler 3 ila 24 saat boyunca, kuru olana kadar azalır şarttır. Metoksiamin hidroklorür (piridin içinde 20 mg / ml) 40 ul ekle. 37 ° C'de 2 saat boyunca yatay bir ısıtma bloğu çalkalayıcıda çalkalanarak 70 ul N-metil-N-ekleme – (trimetilsilil)-trifloroasetamid MSTFA karışımı. 37 ° C'de 2 saat boyunca çalkalanarak 11.000 x g at ~ 1 dk kısa bir santrifüj tarafından kapağında damla aşağı doğru döndürün. GC-MS analizi için uygun olan cam şişeler içine sıvı aktarın. LC-MS tarafından sekonder metabolitler için Metabolit profilleme için 4. Ekstraksiyon Donmuş toprak örnekleri 500 ul metanol ekleyin. 70 ° C (1000 saniye-1) 'de 15 dakika boyunca bir termomikser ile çalkalayın. Örnek (santrifüj 5 min, 20,000 xg) ve 1.5 ml'lik bir santrifüj tüpüne aktarılır, sıvı faz. Bir santrifüj buharlaştırıcı (SpeedVac) ile sıvı fazın liyofilize edilir. Kuru pelet 100 ul ve 100 ul, sikloheksan milliQ su ekleyin. Oda sıcaklığında (kullanım vorteks) 5 dakika boyunca numune çalkalayın. Örnekleri (5 dakika, 20,000 xg) santrifüjleyin. LC-MS analizi için konik dipli LC-MS enjeksiyon şişelerine su fazı (alt faz) 80 ul aktarın. 5. Veri Analizi Xcalibur, MarkerLynx, Metalign 7 veya 8 XCMS yapılandırın ve işlenecek veri analizi seçin. Tablo 1 bileşik sınıfına göre ilgilendiğiniz tespit zirvelerinden bir tablo hazırlayın. Standart bileşiklerin eş elüsyonu ile tepe belirlenmesi. Daha sonra MSn analizi, yapısal karakterizasyon algoritmaları 9,10, edebiyat s kullanılarak tespit zirveleri açıklamaurvey ve metaboliti veritabanı arama 11,12. 6.. Hidrokarbon Ekstraksiyon 13 Taze hasat N. Batmak 2-20 dakika boyunca HPLC grade); glauca yaprakları (metanol, etanol, kloroform, heksan ya da petrol eteri (kaynama noktası 40-60 ° C veya 60-80 ° C) çözücü olarak (~ 200 mg) (5 ml. Yaprakları çıkarın ve döner buharlaştırma ile tamamen kapalı kuru çözücüler. Heksan içinde yeniden süspanse numuneleri (1 mi, HPLC grade). Gaz kromatografisi ve bir 5973MSD için hyphenated kullanarak GC-MS analizi yapın. Çalışma koşulları aşağıdaki gibi olması gerekir; taşıyıcı gaz, 0.9 ml min -1 / 11 psi 'lık bir akış oranı ile helyum. 280 ° C'de bir splitless enjektör ile örnekleri (1 ul) enjekte 4 ° C / dakika ve 320 ° C ile en rampa önce, 5 dakika boyunca 70 ° C de gaz kromatografısi fırın tutun 67.5 dakika 'lık bir toplam süre yapma, bir 10 dakika daha için son sıcaklık tutun. 280 ° C ve p de MS ile arayüzü ayarlamakERFORM 70 eV EI + kullanarak tam tarama modunda MS ve 10 800 D. taranan Başlangıçta kromatogram otomatik MS deconvolution ve tanımlama sistemi bileşenleri ve NIST 98 MS kütüphanesi kullanılarak tespit edilmiş olanlar işlemek. Bilinen otantik standartlara tutma süreleri ve klasik parçalanma desenleri karşılaştırarak uzun zincirli doymuş alkan hidrokarbonlar (hexacosenol, nonacosane, trikontan, octacosenol, nonacosonal, Hentriakontane, dotriacontane ve tritriacontane) tanımlanmasını onaylayın. Otantik standartlar inşa doz yanıt eğrileri (0,07-2,5 mg) ile entegre edilmiş zirve alanlarının karşılaştırılması ile kantitatif olarak hidrokarbonlar belirler. Anlamına gelir ve Excel yazılımı kullanılarak aracı (SEM) standart hatası hesaplayın. Isoprenoitlerin 14 7. Analizi Bölüm 2'de tarif edildiği gibi homojenleştirme yapın. Bir santrifüj tüpüne homojenize dondurularak kurutulmuş tozun 10 mg tartılır. , Tozun üzerine ardışık olarak 250 ml metanol ekle karıştırarak, daha sonra 500 ml kloroform (laboratuar reaktif dereceli) ekleyin ve vorteks yoluyla iyice karıştırılır. 20 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde örnekleri bırakın. Süspansiyona 250 ml Tris-HCl tampon maddesi (100 mM, pH 7.5) ya da su (HPLC derece) ilave edilir ve vorteks ile karıştırın. Sulu fazlardan polar olmayan ayırmak için 5 dakika boyunca 12,000 rpm (13,523 xg) karışımı santrifüj. Isoprenoit özleri ihtiva eden polar olmayan faz, kloroform altındadır. Yeni bir santrifüj tüpüne faz transfer edin. Sulu faz ek 500 ml kloroform ekleyin ve girdap ve yukarıda tarif edildiği gibi santrifüj ile ikinci ekstraksiyon yapmak. Kloroform ekstraktları birleştirin ve analize kadar -20 ° C'de ve bir buharlaştırıcı kullanılarak kuruyana dek mağaza örnekleri getir. Malzemeyi yeniden çözünmesi için kurutuldu isoprenoit ekstreye 50 ml etil asetat (HPLC derece) ilave edin. Bir C18 üzerine 3 ml enjekteUPLC Acquity ayırma modülünü kullanarak sütun. Pigmentleri ayırmak için kullanılan degrade içermelidir; A: metanol / H 2 0 (50:50) ve B: asetonitril / etil asetat (75:25) ve başlangıç ​​koşulları A% 30 (v / v) ve% 70 B (v / v) 100 olacak olmalıdır 6 dakika boyunca% B. 0.6 ml / dk 'lık bir akış hızı kullanarak. 250 600 nm arası Photo Diode Array (PDA) detektörü ile sürekli eluatın izleyin. Co-kromatografi ve otantik standartlar, Beta karoten (provitamin A), fitoen, likopen, lutein ve zeaksantin arasındaki spektral karşılaştırmalar tarafından bileşenleri tanımlar. Doz tepki eğrilerinden ölçümü yapın. LC-MS kullanılarak bileşiklerin onaylamak; ve benzer kromatografik koşullar kullanın. Algılama bir Q-TOF aletle pozitif modda APCI iyonizasyon kullanılarak yapılmalıdır. 1.5 saat boyunca 50 ° C'de% 6 KOH içinde ekstre edilmiş ve sabunlaştırma edilmiş 25 mg dondurularak kurutulmuş madde ile tokoferol belirlenmesi için değişiklik yapın. <pclass = "jove_title"> 8. RNA Sek için RNA Ekstraksiyonu Bu protokol, yüksek kalitede RNA elde etmek için bir RNeasy Kiti ile Trizol RNA ekstraksiyon birleştirir. Bir karıştırıcı öğütücü ile bir metal top ile 2 ml santrifüj tüplerine dondurulmuş bitkisel maddenin 100 mg öğütün. 1 ml Trizol ekleyin. 4 ° C'de 12,000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj malzemeyi Yeni bir reaksiyon tüpüne süpernatant aktarın. , 200 ul kloroform ekleme tüpü birkaç kez ters çevirin ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. 4 ° C'de 12,000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj karışımını Yeni bir reaksiyon tüpüne üst akıcı faz (yaklaşık 700 ul) aktarın. , Etanol, yaklaşık 2.5 hacim (% 100) ekleme tüpü birkaç kez ters çevirin ve -80 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe Kitinden döndürme kolonuna bir çökelti de dahil olmak üzere örnek hareket ettirin. 8,000 x g'de 15 saniye için sütun santrifüj ve f atmakyoluyla düşük. 8,000 x g de santrifüj sütun ve 15 saniye boyunca santrifüje 700 ul Tampon RW1 ekleyin. Yoluyla akış atın. Döndürme kolonuna 500 ul Tampon RPE ekleyin ve 8000 x g 15 saniye için sütun santrifüj. Yoluyla akış atın. 8,000 x g de santrifüj sütun ve 2 dakika boyunca santrifüj ile 500 ul Tampon RPE ekleyin. Yeni bir 1.5 ml reaksiyon tüpüne spin kolon yerleştirin ve 50 ul RNase içermeyen su ekleyin. RNA elüt edilmesi için 8000 x g 'de, 1 dakika için sütun santrifüjleyin. Üreticinin talimatlarına göre bir Ambion DNA-free Kit kullanılarak kalıntı DNA çıkarın. RNA kalitesini belirler. RNA, 8'in yukarısında RNA bütünlüğü numaralarını (RIN) olması gerekir. Yeni nesil dizileme için RNA uğurlanacak.