Trascrizione e metabolita Profiling per la valutazione del Tabacco Albero e pioppo come materia prima per l'industria con sede a Bio

1. Materiale Pianta Crescere le piante Nicotiana glauca in 30 vasi cm di diametro contenenti M2 mezzo di crescita professionale. Crescere le piante in serra, con una temperatura diurna di 20-25 ° C e la temperatura notturna di 15 ° C. Utilizzare una luce 16 ore e 8 ore di ciclo buio come regime luce supplementare. 2. Preparazione del campione Per metaboliti primari: Materiali vegetali Harvest (foglie e steli di N. glauca) e materiale di congelare immediatamente. Lyophilize materiali vegetali congelati liofilizzazione per tre giorni. Grind campioni liofilizzati da mulino mixer con sfere di metallo. Aliquota terra multa materiali secchi in una provetta da 2 ml o flaconcino di vetro. Per metaboliti secondari: Tessuti vegetali Harvest e materiale congelare immediatamente. Grind tessuti vegetali congelati mmulino a ixer con sfera in acciaio inox o con mortaio e pestello. Aliquota pregiati tessuti di terra in 2 ml centrifuga tubo (circa 20 mg di peso umido). 3. Estrazione Protocollo per Metaboliti Profiling per metaboliti principali mediante GC-MS Terra aliquota materiale vegetale secco (10 mg di foglia e 20 mg di materiali staminali) in 2 ml, tappo, tubi circolari. Aggiungere 1,400 ml di metanolo 100% e vortex per 10 sec. Aggiungere 60 ml di Ribitolo (0,2 mg / ml di archivi in H 2 O) come standard quantitativo interno e vortex per 10 sec. Aggiungere un acciaio inossidabile (o zirconia) in profondità e omogeneizzare materiale con un mulino miscelatore per 2 min a 25 Hz. Centrifugare la miscela per 10 min a 11.000 x g. Trasferire il surnatante in un flacone di vetro. Aggiungere 750 ml di cloroformio. Aggiungere 1,500 ml di H 2 O e agitare la miscela per 10 sec. Trasferire 150 microlitri dalfase superiore (fase polare) in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 ml. Campioni a secco utilizzando una vac velocità. E 'indispensabile che i campioni sono ridotti a secco tra il 3 e 24 ore fino a quando non liquido residuo è presente. Aggiungere 40 ml di Methoxyamine cloridrato (20 mg / ml in piridina). Agitare la miscela in un blocco riscaldante agitatore orizzontale per 2 ore a 37 ° C. Aggiungere 70 ml N-metil-N – (trimetilsilil)-trifluoroacetamide mix MSTFA. Agitare la miscela per 2 ore a 37 ° C. Spin giù le gocce sul coperchio con un breve centrifugazione ~ 1 min a 11.000 x g. Trasferire il liquido in fiale di vetro idonei per l'analisi GC-MS. 4. Estrazione di metaboliti secondari Profiling per metaboliti mediante LC-MS Aggiungere 500 ml di metanolo ai campioni terreno ghiacciato. Agitare con un thermomixer per 15 min a 70 ° C (1,000 sec -1). Centrifugare i campioni (5 kmn, 20.000 xg) e la fase liquida trasferito in una provetta da centrifuga da 1,5 ml. Liofilizzare la fase liquida con un evaporatore centrifugo (speedvac). Aggiungere 100 microlitri cicloesano e 100 microlitri di acqua milliQ al pellet asciutto. Agitare i campioni per 5 min a temperatura ambiente (uso vortice). Centrifugare i campioni (5 min, 20.000 XG). Trasferire 80 ml di fase acquosa (fase inferiore) per fiale LC-MS con fondo conico per l'analisi LC-MS. 5. Analisi dei dati Configurare Xcalibur, MarkerLynx, Metalign 7 o 8 XCMS e selezionare l'analisi dei dati da elaborare. Preparare un tavolo di picchi rilevati di tuo interesse in conformità con classe di composti nella Tabella 1. Identificare i picchi da co-eluizione di composti standard. Successivamente annotare picchi rilevati tramite analisi MSN, algoritmi di caratterizzazione strutturale 9,10, letteratura survey e metabolita ricerca del database 11,12. 6. Idrocarburi Estrazione 13 Immergere N. appena raccolte foglie glauca (~ 200 mg) in solvente (metanolo, etanolo, cloroformio, esano o etere di petrolio (punto di ebollizione 40-60 ° C o 60-80 ° C) (5 ml; qualità HPLC) da 2 a 20 min. Togliere le foglie e asciugare completamente solventi per evaporazione rotante. Campioni Risospendere in esano (1 ml; qualità HPLC). Eseguire l'analisi GC-MS mediante gascromatografia e la sillabazione di un 5973MSD. Condizioni operative devono essere le seguenti; gas di trasporto elio con un flusso di 0,9 ml min -1 / 11 psi. Iniettare campioni (1 mL) con un iniettore splitless a 280 ° C. Tenere il forno gascromatografia a 70 ° C per 5 min prima della rampa a 4 ° C / min a 320 ° C. Mantenere la temperatura finale per altri 10 min, per un tempo totale di 67,5 min. Impostare l'interfaccia con la MS a 280 ° C e peffettuare la giusta MS in modalità di scansione completa con 70 eV EI + e scansionata 10-800 D. Inizialmente elaborare i componenti cromatogramma di deconvoluzione MS automatico e sistema di identificazione, e quelli che vengono identificati utilizzando la libreria NIST 98 MS. Confermare l'individuazione di idrocarburi saturi a catena lunga alcano (hexacosenol, nonacosano, triacontane, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane e tritriacontane) confrontando i tempi di ritenzione e modelli di frammentazione classici standard autentici noti. Determinare gli idrocarburi quantitativamente confrontando aree di picco integrate con le curve dose-risposta (0,07-2,5 mg), costruiti dagli standard autentici. Calcola mezzi e errore standard dei mezzi (SEM) utilizzando il software Excel. 7. Analisi degli isoprenoidi 14 Eseguire omogeneizzazione come descritto nella sezione 2. Pesare 10 mg di congelamento omogeneizzati polvere essiccata in una provetta da centrifuga. Aggiungi sequenziale da 250 ml di metanolo sulla polvere, mescolare, quindi aggiungere 500 ml di cloroformio (laboratorio di grado reagente), e mescolare nel vortex. Lasciare i campioni sul ghiaccio al buio per 20 min. Aggiungere 250 ml di tampone Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) o acqua (qualità HPLC) alla sospensione e mescolare nel vortex. Centrifugare la miscela a 12.000 rpm (13.523 xg) per 5 minuti per separare il apolare da fasi acquose. La fase cloroformio non polare contenente estratti isoprenoidi è in fondo. Trasferire la fase in un tubo da centrifuga. Aggiungere un ulteriore 500 ml di cloroformio per la fase acquosa, e condurre una seconda estrazione con vortice e centrifugazione come descritto sopra. Combinare gli estratti di cloroformio e portare i campioni a secchezza usando l'evaporatore e conservare a -20 ° C fino all'analisi. Aggiungere 50 ml di acetato di etile (grado HPLC) per l'estratto secco isoprenoidi per ridisciogliere il materiale. Iniettare 3 ml su un C18colonna utilizzando un modulo di separazione UPLC. Il gradiente utilizzato per separare i pigmenti dovrebbe comprendere; A: metanolo / H 2 0 (50:50) e B: acetato di acetonitrile / etile (75:25), e le condizioni iniziali devono essere 30% (v / v) e B 70% (v / v) andando a 100 % B oltre 6 min. Utilizzare una portata di 0,6 ml / min. Monitorare l'eluato continuamente con un Array Photo Diode (PDA) rilevatore di 250-600 nm. Identificare i componenti mediante co-cromatografia e confronti spettrali tra le norme autentici, Beta-carotene (provitamina A), fitoene, licopene, luteina e zeaxantina. Eseguire la quantificazione da curve dose-risposta. Confermare composti utilizzando la LC-MS; utilizzare condizioni cromatografiche simili. Rilevamento deve essere eseguita utilizzando APCI di ionizzazione in modo positivo con uno strumento Q-Tof. Apportare le modifiche per la determinazione tocoferolo con 25 mg freeze materiale secco che è stato estratto e saponificazione a 6% KOH al 50 ° C per 1,5 ore. <pclass = "jove_title"> 8. RNA Estrazione di RNA Seq Questo protocollo unisce l'estrazione di RNA Trizol con un kit RNeasy per ottenere RNA di alta qualità. Macinare 100 mg di materiale vegetale congelato in 2 ml provette da centrifuga con una sfera di metallo mediante un mulino miscelatore. Aggiungere 1 ml di Trizol. Centrifugare il materiale per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di reazione. Aggiungere 200 microlitri cloroformio, capovolgere la provetta diverse volte, e incubare 3 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la miscela per 15 minuti a 12.000 xg a 4 ° C. Trasferire la fase acquosa superiore (circa 700 ml) in un nuovo tubo di reazione. Aggiungere circa 2,5 volumi di etanolo (100%), invertire la provetta diverse volte, e incubare per 30 minuti a -80 ° C. Spostare il campione compreso l'eventuale precipitato alla colonna di spin dal kit. Centrifugare la colonna per 15 sec a 8.000 xg, e scartare il fbasso attraverso. Aggiungere 700 microlitri Buffer RW1 alla colonna di spin e centrifugare per 15 sec a 8.000 x g. Gettare il flusso attraverso. Aggiungere 500 microlitri Buffer RPE alla colonna di spin e centrifugare la colonna per 15 sec a 8.000 x g. Gettare il flusso attraverso. Aggiungere 500 microlitri Buffer RPE alla colonna di spin e centrifugare per 2 min a 8.000 x g. Porre la colonna di spin in un nuovo tubo di reazione da 1,5 ml e aggiungere 50 di acqua RNase-free microlitri. Centrifugare la colonna per 1 min a 8000 xg per eluire l'RNA. Rimuovere il DNA residuo utilizzando un kit di connessione-DNA Ambion secondo le istruzioni del produttore. Determinare la qualità dell'RNA. L'RNA dovrebbe avere i numeri integrità dell'RNA (RIN) di cui sopra 8. Inviare via l'RNA per sequenziamento di nuova generazione.