Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

Colin Ruprecht; Takayuki Tohge; Alisdair Fernie; Cara L. Mortimer; Amanda Kozlo; Paul D. Fraser; Norma Funke; Igor Cesarino; Ruben Vanholme; Wout Boerjan; Kris Morreel; Ingo Burgert; Notburga Gierlinger; Vincent Bulone; Vera Schneider; Andrea Stockero; Juan Navarro-Avi&#241;&#243;; Frank Pudel; Bart Tambuyser; James Hygate; Jon Bumstead; Louis Notley; Staffan Persson

doi:10.3791/51393

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环境科学

Transcript und Metabolite Profiling für die Beurteilung von Tabakbaum und Pappel als Rohstoff für die Bio-basierte Industrie

Published: May 16, 2014

doi:

10.3791/51393

Colin Ruprecht¹, Takayuki Tohge¹, Alisdair Fernie¹, Cara L. Mortimer², Amanda Kozlo², Paul D. Fraser², Norma Funke¹, Igor Cesarino^3,4, Ruben Vanholme^3,4, Wout Boerjan^3,4, Kris Morreel^3,4, Ingo Burgert^5,6, Notburga Gierlinger^5,6, Vincent Bulone⁷, Vera Schneider⁸, Andrea Stockero⁸, Juan Navarro-Aviñó⁹, Frank Pudel¹⁰, Bart Tambuyser¹¹, James Hygate¹², Jon Bumstead¹³, Louis Notley¹³, Staffan Persson^1,14

¹Max Planck Institute for Molecular Plant Physiology, ²School of Biological Sciences, Plant Molecular Science, Centre for Systems and Synthetic Biology,Royal Holloway, University of London, ³Department of Plant Systems Biology,VIB, ⁴Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics,UGhent, ⁵Institute for Building Materials,ETH Zurich, ⁶Applied Wood Materials,EMPA, ⁷Division of Glycoscience, School of Biotechnology, AlbaNova University Center,Royal Institute of Technology (KTH), ⁸European Research and Project Office GmbH, ⁹ABBA Gaia S.L., ¹⁰Pflanzenöltechnologie, ¹¹Capax Environmental Services, ¹²Green Fuels, ¹³Neutral Consulting Ltd, ¹⁴Plant Cell Biology Research Centre, School of Botany,University of Melbourne

Summary

Pflanzenbiomasse bietet eine erneuerbare Ressource für mehrere Produkte, einschließlich Kraftstoff, Futtermittel-, Lebensmittel-und einer Vielzahl von Materialien. In diesem Papier untersuchen wir die Eigenschaften von Tabakbaum (Nicotiana glauca) und Pappel als geeignete Quellen für eine Bioraffinerie-Pipeline.

Abstract

Die weltweite Nachfrage nach Lebensmitteln, Futtermitteln, Energie und Wasser stellt außergewöhnliche Herausforderungen für zukünftige Generationen. Es ist offensichtlich, dass stabile Plattformen für die Erforschung von erneuerbaren Ressourcen notwendig, um diese Herausforderungen zu meistern sind. Innerhalb der multinationalen Rahmen MultiBioPro entwickeln wir Bioraffinerie-Pipelines, um die Nutzung pflanzlicher Biomasse zu maximieren. Genauer gesagt, verwenden wir Pappelbaum und Tabak (Nicotiana glauca) als Zielkulturarten zur Verbesserung der Verzuckerung isoprenoiden, langkettigen Kohlenwasserstoff Inhalte, Faserqualität und Suberin und Lignin Inhalte. Die Ausgänge verwendet, um diese zu erhalten Methoden gehören GC-MS, LC-MS-und RNA-Sequenzierungsplattformen. Der Metabolit Pipelines gut etabliert Werkzeuge, um diese Arten von Daten zu erzeugen, sondern auch über die Grenzen daß nur gut charakterisiert Metaboliten verwendet werden. Die tiefe Sequenzierung wird uns erlauben, alle während der Entwicklungsstadien der Tabak Baum Blatt vorliegenden Abschriften, aber h sind, um zurück zu der Sequenz von Nicotiana tabacum abgebildet werden. Mit diesen Set-ups, zielen wir auf ein grundlegendes Verständnis für die zugrunde liegenden Prozesse und auf die Schaffung einer industriellen Rahmen, um die Ergebnisse zu nutzen. In einer langfristigen Perspektive, glauben wir, dass die Daten hier erzeugt wird, Mittel für eine nachhaltige Bioraffinerie-Verfahren unter Verwendung von Pappel-und Tabak Baum als Rohstoff zu liefern. Um das Basisniveau von Metaboliten in den Proben heute wurden analysiert und die verwendeten Protokolle sind in diesem Artikel bereitgestellt.

Introduction

Bevölkerungs-und Wirtschaftswachstum haben einen steigenden Bedarf an Nahrung, Wasser und Brennstoffe verursacht wird. Viele dieser Versorgung hergestellt, verarbeitet und transportiert Finite fossilen Mittel, wie Mineralöl. Es ist jedoch klar, dass diese Praxis nicht nachhaltig, und die Entwicklung von alternativen Ressourcen werden daher von großer Bedeutung ¹ sein. Viele erneuerbare Ressourcen sind, in unterschiedlichem Maße, derzeit ausgenutzt, darunter Wind-, Wasser-Bewegung, Sonne, Erdwärme, Wellen-und Energieträger. Eine weitere nachhaltige und weitgehend ungenutzte Ressource ist die Biomasse aus Pflanzen. Diese Ressource bietet auch eine sehr kostengünstige Möglichkeit, Solarenergie in abgeleiteten Brennstoffe ² konvertieren. Neben der biologisch basierten Kraftstoff bietet die pflanzliche Biomasse auch einzigartige Möglichkeiten für alternative Produkte, einschließlich Kunststoffe, Waschmittel, und wertvolle Chemikalien.

Die Pflanzenzellwand, die größtenteils aus Zucker basierten Polymeren, makES bis die Hauptmasse der Biomasse der Pflanze und viel Aufwand wird derzeit in der effizienten Umwandlung in Bioethanol investiert. Die restliche Biomasse kann anschließend in Biogas-und Öl ³ verwandte Produkte verarbeitet werden. Ein Großteil der mehrjährige Pflanzenarten, darunter Gräser und Bäume, die große Mengen von Zellulose-Biomasse erzeugen typischerweise wachsen am besten in den gemäßigten Zonen. Allerdings ist etwa 20% der Landfläche semi-ariden und ist daher auch anfällig für Dürren ^4. Natürlich wäre es von Interesse sein, auch diese Trockengebiete pflegen mit Pflanzen, die effektiv auf die nachhaltige Produktion von Energie-und Material beitragen könnten. Diese Pflanzen brauchen, um eine optimale Effizienz der Wassernutzung und Trockenheitsresistenz und würde den Tabak-Baum (Nicotiana glauca) und Arten der Gattung Agave enthalten.

Die MultiBioPro Konsortium soll eine integrierte Bioraffinerie-Pipeline zu implementieren, mit dem zwei wichtige crop-Arten, Pappel-und Tabakbaum. Pappel als vielversprechender Biokraftstoff-Pflanze entstanden, wie es wächst schnell, einfach klonal vermehrt und sehr anpassungsfähig an einer breiten Palette von Klima-und Bodenbedingungen. Es bietet auch eine große Auswahl an Holz-, Faser-, Brennstoff Holz und andere Waldprodukte ^5. Die Tabak Baum wurde auch als einer geeigneten Anlage für Biokraftstoffe und Bioraffinerie Zwecke. Es erzeugt in der Regel erhebliche Mengen von Biomasse, enthält hohe Mengen an nicht-strukturellen Kohlenhydrate ^6, und hat auch die seltene Fähigkeit, große Mengen von leicht extrahierbaren Nonfood-Öle (einschließlich langen Kette C _{29-C 31} gesättigten Kohlenwasserstoffen und Triterpene), die für Biodiesel geeignet sind akkumulieren Produktion. Die Tabakbaum ist darüber hinaus offen für die genetische Verbesserung, hat eine hohe Keimfähigkeit und wächst glücklich auf semi-ariden Böden nicht für die Lebensmittelproduktion verwendet. Es scheint daher, dass sowohl Pappel und Tabak Baum intrinsische Potential für multipWECK Kulturen, dh als neue, hochwertige Rohstoffe für eine integrative bio-basierten Industrie. In diesem Beitrag konzentrieren wir uns auf vielfältige Reihe von Ansätzen zu erkennen, wie Tabak Baum Einlagen langkettigen Kohlenwasserstoffen.

In einem Versuch, die zugrunde liegenden molekularen Maschinen für die Produktion und Sekretion von den gesättigten langkettigen Kohlenwasserstoffen auf die Tabakblätter verantwortlich sind, wenden wir moderne "Omics"-Technologien basiert. Dies beinhaltet RNA seq einer Entwicklungs Blatt-Serie (zehn Stufen) und Multiplattform-Metabolite Profiling-Ansätze unter Verwendung LC und GC-MS (für polare und unpolare Metaboliten und Lipidomics). Diese Daten werden verwendet, um für die Genexpression, die mit korreliert oder vorausgeht, dem Beginn der Biosynthese der oben genannten Moleküle abbauen werden. Gene und Signalwege, die vielversprechend aus diesen Bemühungen erscheint für Funktionstests in der Modellpflanze Arabidopsis verwendet werden und könnte letztlich zugänglich für biotechnologische Technik in tob seinacco Baum.

Protocol

1. Pflanzenmaterial Nicotiana glauca wachsen Pflanzen in 30 cm Durchmesser Töpfe mit M2 professional wachsende Medium. Wachsen Pflanzen im Gewächshaus, mit einer Tagestemperatur von 20-25 ° C und Nachttemperatur von 15 ° C. Verwenden Sie eine 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit-Zyklus als zusätzliche Lichtregime. 2. Probenvorbereitung Für die Haupt-Metabolite: Ernte Pflanzenmaterial (Blätter und Stängel von N. glauca) und gefrier Material sofort. Lyophilisieren gefrorene Pflanzenmaterial durch Gefriertrocknung für drei Tage. Grind gefriergetrockneten Proben durch Schwingmühle mit Metallkugeln. Aliquot fein geschliffen trockenen Materialien in ein 2 ml Zentrifugenröhrchen oder Glasfläschchen. Für Sekundärmetaboliten: Ernte Pflanzengewebe und gefrier Material sofort. Grind gefrorene Pflanzengewebe durch mixer Mühle mit Edelstahlkugel oder durch Mörser und Stößel. Aliquot fein geschliffen Gewebe in 2 ml-Zentrifugenröhrchen (ca. 20 mg Feuchtgewicht). 3. Extraction Protokoll für die Metabolite Profiling für primäre Metaboliten durch GC-MS Aliquot Boden trocken Pflanzenmaterial (10 mg und 20 mg Blatt der Stamm Materialien) in 2 ml, Schraubverschluss, Rundbodenröhrchen. In 1400 ul von 100% Methanol und Vortex für 10 Sekunden. In 60 ul Ribitol (0,2 mg / ml Stamm in H 2 O) als interner Standard und quantitative Vortex für 10 Sekunden. In einem Edelstahl (oder Zirkonoxid) Ball und homogenisieren Material mit einer Schwingmühle für 2 min bei 25 Hz. Zentrifugieren Sie die Mischung für 10 min bei 11.000 x g. Den Überstand in ein Glasfläschchen. In 750 ul Chloroform. In 1500 ul H 2 O und verwirbeln die Mischung für 10 Sekunden. Überweisung von 150 ul derOberphase (polare Phase) in ein frisches 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen. Trockenproben mit einer Geschwindigkeit vac. Es ist zwingend notwendig, dass die Proben zur Trockene einge zwischen 3 und 24 Stunden reduziert wird, bis keine Restflüssigkeit vorhanden ist. 40 &mgr; l Methoxyaminhydrochlorid (20 mg / ml in Pyridin). Schütteln der Mischung in einer horizontalen Heizblock Schüttler für 2 h bei 37 ° C. Add 70 ul N-Methyl-N – (trimethylsilyl)-trifluoracetamid MSTFA Mischung. Schütteln Sie die Mischung für 2 Stunden bei 37 ° C Spin down die Tropfen auf dem Cover durch eine kurze Zentrifugation ~ 1 min bei 11.000 x g. Die Flüssigkeit in Glasfläschchen für GC-MS-Analyse. 4. Extraktion für Metabolite Profiling für Sekundärmetabolite durch LC-MS In 500 ul Methanol zu den gefrorenen Bodenproben. Shake mit einem Thermomixer für 15 min bei 70 ° C (1.000 s -1). Zentrifugieren Sie die Proben (5 kmn, 20.000 × g) und das in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführt flüssigen Phase. Lyophilisieren der flüssigen Phase mit einer zentrifugalen Verdampfer (SpeedVac). 100 l Cyclohexan und 100 ul Milli-Q-Wasser auf die trockene Pellets. Schütteln der Proben für 5 min bei Raumtemperatur (Verwendung Vortex). Zentrifugieren der Proben (5 min, 20.000 xg). Übertragen Sie 80 ul der Wasserphase (untere Phase) LC-MS-Injektionsflaschen mit konischen Boden für die LC-MS-Analyse. 5. Data Analysis Konfigurieren Xcalibur, MarkerLynx, Metalign 7 oder 8 XCMS und wählen Sie die Datenanalyse verarbeitet werden. Bereiten Sie eine Tabelle der erfassten Spitzen von Ihrem Interesse nach Verbindungsklasse in Tabelle 1. Identifizieren Spitzen, die durch Co-Elution von Standardverbindungen. Anschließend kommentieren detektierten Peaks mit MSN Analyse, strukturelle Charakterisierung Algorithmen 9,10, Literatur survey und Metabolit-Datenbanksuche 11,12. 6. Kohlenwasserstoff-Extraktion 13 Tauchen Sie frisch geernteten N. glauca Blätter (~ 200 mg) in einem Lösungsmittel (Methanol, Ethanol, Chloroform, Hexan oder Petrolether (Siedepunkt 40-60 ° C oder 60-80 ° C) (5 ml, HPLC-Qualität) für 2 bis 20 min. Blätter entfernen und vollständig trocknen Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung. Resuspendieren Proben in Hexan (1 ml, HPLC-Qualität). Führen GC-MS-Analyse mit Gaschromatographie und Bindestrich zu einem 5973MSD. Betriebsbedingungen sollte wie folgt; Trägergas Helium mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,9 ml min -1 / 11 psi. Injizieren Proben (1 ul) mit einer Splitless-Injektor bei 280 ° C Halten Sie die Gaschromatographie Schrank bei 70 ° C für 5 min vor dem Hochfahren bei 4 ° C / min bis 320 ° C. Halten Sie das endgültige Temperatur für weitere 10 min, so dass eine Gesamtzeit von 67,5 min. Einstellen der Schnittstelle mit der MS bei 280 º C und perform MS im Full-Scan-Modus mit 70 eV EI + und von 10 bis 800 D. gescannt Zunächst verarbeitet die Komponenten Chromatogramm durch automatisierte MS Entfaltung und Identifikationssystem, und solche, die unter Verwendung der NIST-98 MS-Bibliothek identifiziert werden. Bestätigen Sie die Identifikation von gesättigten langkettigen Alkan-Kohlenwasserstoffe (hexacosenol, Nonacosan, Triacontan, octacosenol, nonacosonal, Hentriacontan, Dotriacontan und tritriacontane) durch den Vergleich Retentionszeiten und klassische Fragmentierungsmuster zu bekannten authentischen Standards. Bestimmen Sie quantitativ Kohlenwasserstoffe durch den Vergleich integrierten Peakflächen mit der Dosis-Wirkungs-Kurven (0,07 bis 2,5 mg), von authentischen Standards gebaut. Berechnet Mittelwerte und Standardfehler der Mittelwerte (SEM) unter Verwendung von Excel-Software. 7. Analyse der Isoprenoide 14 Führen Homogenisierung, wie in Kapitel 2 beschrieben. Wiegen in 10 mg gefriergetrocknetes Pulver homogenisiert, in ein Zentrifugenröhrchen. In der Reihe 250 ml Methanol auf das Pulver, mischen Sie es, dann fügen Sie 500 ml Chloroform (Laborreagens grade), und mischen Sie es mit einem Vortex. Lassen Sie die Proben auf Eis im Dunkeln für 20 min. In 250 ml Tris-HCl-Puffer (100 mM, pH 7,5) oder Wasser (HPLC-Qualität) zu der Suspension und vortexen. Zentrifugieren der Mischung bei 12.000 rpm (13.523 × g) für 5 min, um das nichtpolare aus wässrigen Phasen zu trennen. Die unpolare Phase, die Chloroform-Extrakte Isoprenoid ist an der Unterseite. Übertragen der Phase in ein neues Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie eine zusätzliche 500 ml Chloroform zu der wässrigen Phase, und führen eine zweite Extraktion durch Wirbel und Zentrifugation wie oben beschrieben. Kombinieren Sie die Chloroform-Extrakte und bringen die Proben bis zur Trockene mit dem Verdampfer und bei -20 ° C bis zur Analyse. 50 ml Ethylacetat (HPLC-Qualität) auf die getrocknete Extrakt isoprenoiden, um das Material wieder zu lösen. Inject 3 ml auf eine C18-Säule mit einem UPLC Acquity Trennmodul. Die verwendete, um die Pigmente zu trennen Gradienten sollte beinhalten; A: Methanol / H 2 0 (50:50) und B: Acetonitril / Ethylacetat (75:25), und die Anfangsbedingungen sollte eine 30% ige (v / v) und B 70% (v / v) würde 100 % B über 6 min. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 0,6 ml / min. Überwachung des Eluats kontinuierlich mit einem Photodiodenarray (PDA)-Detektor von 250 bis 600 nm aufweist. Identifizieren Komponenten durch Co-Chromatographie und spektrale Vergleiche zwischen authentischen Standards, Beta-Carotin (Provitamin A), Phytoen, Lycopin, Lutein und Zeaxanthin. Führen Quantifizierung von Dosis-Wirkungs-Kurven. Bestätigen Verbindungen mittels LC-MS; verwenden ähnliche chromatographischen Bedingungen. Der Nachweis sollte mit APCI Ionisation in positiven Modus mit einem Q-Tof Instrument durchgeführt werden. Sind die Änderungen für die Bestimmung Tocopherol mit 25 mg gefriergetrocknetes Material, das bei 50 ° C für 1,5 Stunden extrahiert worden ist und die Verseifung in 6% KOH. <pclass = "jove_title"> 8. RNA-Extraktion für die RNA-Seq Dieses Protokoll verbindet Trizol-RNA-Extraktion mit einem RNeasy Kit, um qualitativ hochwertige RNA zu erhalten. Grind 100 mg gefrorene Pflanzenmaterial in 2 ml Zentrifugenröhrchen mit einer Metallkugel durch einen Mischer Mühle. 1 ml Trizol. Zentrifugieren des Materials für 10 Minuten bei 12.000 × g bei 4 ° C. Den Überstand in ein neues Reaktionsröhrchen. In 200 ul Chloroform, das Röhrchen mehrmals, und Inkubation von 3 min bei Raumtemperatur. Zentrifugieren der Mischung für 15 min bei 12.000 × g bei 4 ° C. Wird die obere wäßrige Phase (ca. 700 &mgr; l) in ein neues Reaktionsröhrchen. In ca. 2,5 Volumen Ethanol (100%), das Röhrchen mehrmals, und Inkubation für 30 min bei -80 ° C Bewegen der Probe einschließlich der Niederschlag auf die Spinsäule von Kits. Zentrifugieren Sie die Spalte für 15 Sekunden bei 8.000 g, und entsorgen Sie die fNieder durch. Add 700 ul Puffer RW1 auf die Spinsäule und zentrifugieren für 15 sec bei 8.000 x g. Die Durchströmung zu verwerfen. Gib 500 ul Puffer RPE auf die spin-Säule und Zentrifugieren der Säule für 15 sec bei 8.000 x g. Die Durchströmung zu verwerfen. Gib 500 ul Puffer RPE auf die spin-Säule zentrifugieren für 2 min bei 8.000 x g. Legen Sie die Spin-Säule in ein neues Reaktionsgefäß 1,5 ml und 50 ul RNase-freies Wasser. Zentrifugieren der Säule für 1 min bei 8.000 × g, um die RNA zu eluieren. Rückstände von DNA mit einem DNA-frei Ambion Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Bestimmen Sie die Qualität der RNA. Die RNA sollte über 8 RNA-Integrität Nummern (RIN) haben. Senden Sie die RNA für die nächste Generation Sequenzierung.

Representative Results

Das HPLC-Profil in Fig. 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis der Isoprenoid-Analyse von N. glauca Blattextrakten. Die verschiedenen Isoprenoiden von C40 und oben wurden mit einem Fotodiodenarray (PDA)-Detektor nachgewiesen. Die Spitzen wurden basierend auf Co-Chromatographie und der spektralen Vergleich zwischen authentischen Standards, Beta-Carotin (Provitamin A), Phytoen, Lycopin, Lutein und Zeaxanthin kommentiert. Die beiden MS-Chromatogramme in Abbildung 2 zeigen das Ergebnis der Analyse von primären Metaboliten N. glauca Blatt-und Stammmaterial auf. Das MS-Spektrum eines Peaks, der Serin (durch einen Pfeil angedeutet) wird auch als ein Beispiel gegeben. Fig. 3 zeigt die Bioanalyzer zur Bestimmung der Qualität der RNA und ein repräsentatives Ausgangssignal von der Vorrichtung verwendet. Die beiden Haupt-Peaks im Chromatogramm entspricht, 18 S und 25 S ribosomalen RNA, was intakte RNA in der Probe. Weitere Gipfel der fragmentierten Rippeosomal RNA würde im Falle der teilweise oder stark degradierten RNA angezeigt. Abbildung 1. HPLC-Profil zeigen, in Blattextrakten von N. vorhanden Isoprenoiden glauca. meisten Isoprenoide von C40 und darüber nicht zugänglich sind GC-MS-Analyse. Wir haben daher HPLC-Trennungen mit Photodiodenarray-Detektion. Ein typisches Chromatogramm bei 450 nm aufgezeichnet gezeigt. Die Carotinoid-Pigmente sind typisch für photosynthetischen Geweben mit Lutein wiegt. Ebenfalls anwesend ist Zeaxanthin, die nur selten in Blattgewebe zu finden ist, es sei denn unter Hochlichtstress gelegt. Die Ebenen von Zeaxanthin machen es eine gute Quelle dieser hochwertigen Verbindung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere v ansehenersion dieser Figur. 2. MS-Chromatogramm und Bandbreite der N. glauca Gewebeextrakten. Insgesamt Ionen-MS-Chromatogramm (TIC) von Blatt und Stamm-Extrakte mit GC-MS gemessen wird vorgestellt (70 bis 600 m / z). GC-MS-Analyse wurde wie zuvor in 15 beschrieben durchgeführt. Erkannt Peaks wurden mit Hilfe der Massenspektrenbibliothek Tags annotiert. MS-Spektrum von Serin (2TMS) als ein Beispiel gezeigt. MS-Chromatogramm: X-Achse und Y-Achse angeben Retentionszeit (min) und die Intensität (Fülle) des Signals, MS-Spektrum: X-Achse und Y-Achse zeigen die M / Z-Verhältnisse und die Intensität (Fülle) des Signals. Klicken Sie hier, um zu vergrößernBild. Abbildung 3. Bioanalyzer Messung von RNA zur RNA-Seq von N. vorbereitet glauca Blattmaterial. Um hochreine RNA zur RNA-Seq wir extrahierte RNA mit Trizol-Reagenz und anschließend gereinigt die RNA mit den Spalten aus dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) benötigt zu erhalten. Wir bestimmten die RNA-Qualität mit dem Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Deutschland) auf der linken Seite angezeigt. Ein Beispiel eines Bioanalyzer Ausgang rechts angegeben. Die beiden Hauptgipfel in der Probe vertreten 18 S und 25 S ribosomalen RNA. Unsere Probe zeigte einen RNA Integrity Number (RIN) von 9,2, was deutlich über dem geforderten Wert von 8 ist. Klicken sieE für eine größere Ansicht.

Discussion

Die hier vorgestellten Protokolle bieten einen umfassenden Rahmen für Tabak Baumblätter für Metaboliten und Transkripte zu analysieren. Es ist vorgesehen, dass diese gemeinsamen Anstrengungen sollten uns neue Einblicke in die Prozesse der Synthese und Extrusion der Kohlenwasserstoffe und der in diesem Gewebe vorhandenen hohen Wert zugrunde liegenden Verbindungen bereitzustellen. Diese Ansätze sollten daher geben uns ein besseres Verständnis dafür, wie die Verbindungen werden synthetisiert. Neben den Tabak Baum Aspekte der Arbeit, ist es auch Ziel, Pappel Biomasse verbessern, vor allem Targeting Verholzung der Sekundärwandstruktur, sondern auch zu erforschen, ob wir die Rinde für die Extraktion von wertvollen Verbindungen zu verwenden.

Die in diesem Beitrag vorgestellten Methoden sind leichte Modifikationen von standardisierten Methoden zur Metabolit-Profiling. Diese Verfahren sind natürlich auf bekannte metabolische Profile beschränkt, und es ist möglich, dass mehrere neue metabolische Peaks für w erhalten werden,elche keine Verbindung bekannt ist. Wir hoffen, dass diese Verbindungen im Kontext zu anderen Metaboliten durch die Kombination das Verhalten von Metaboliten und Transkripte über den Entwicklungszeitreihen setzen.

Keine der hier vorgestellten Verfahren sind in der Regel deutlich von Pflanzenmaterialien eingesetzten Verfahren verändert. Der interessante Aspekt liegt in der Kombination von Methoden, um die zugrunde liegende Framework für hauptsächlich langkettige Kohlenwasserstoffproduktion und Veränderung in den Tabakbaumblätter zu verstehen. Einer der kritischen Schritte zum Erhalten dieser Informationen ist die nachfolgende Kombination der verschiedenen Datentypen. Wir sehen, dass die Daten als eine erste Bewertung werden verschiedene Cluster eingeteilt werden, basierend auf dem Verhalten der Metaboliten / Transkripte über die Entwicklung und dass diese Daten dazu verwendet werden, Transkript gegen Stoffwechselverhalten abzuleiten, und auf bestimmte Stoffwechselwege potentiell zuweisen . Darüber hinaus sind weitere aufwendige Netzwerk-basierten Analysen dann vorgesehen to nutzen kausale Zusammenhänge.

Die analytischen Protokolle hier vorgestellt wird auch eine Grundlage für die Feldversuche und industrielle Nutzung von Biomasse. Um dies zu erreichen, enthält die MultiBioPro Konsortium mehreren Industriepartnern, die die Fähigkeiten haben, weiter zu erforschen, die Biomasse, mit dem Ziel, Biodiesel, Bioethanol und andere hochwertige Verbindungen zu liefern. Diese Arten von Biomasse-Nutzung wird auf der Grundlage bewertet werden; (1) Prüfung der Robustheit und Qualität der Bio-Produkte hergestellt (typische Industriestandard-Tests durchgeführt, um sicherzustellen, dass die erzeugten Produkte haben gute Marktwert werden), (2), eine wirtschaftliche, soziale und ökologische Bewertung der Technologien durchgeführt werden unter Verwendung von Literaturquellen, Interviews und Material, das während der Feldversuche und Pilotanlage Bioraffinerie Einschätzungen erzeugt wird. Diese Aktivitäten gehören Kosten-Nutzen-und Lebenszyklusanalyse, die Erstellung eines Umweltdossiers, Markt-und business-Strategien. Wir glauben, dass diese Pipeline wird eine nützliche Mischung aus Wissenschaft geworden, angewandte Wissenschaft und industrielle Nutzung, weitere Pappel-und Tabak-Baum-Biomasse für die Verbraucher End-Produkte.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MultiBioPro möchte den folgenden Personen, die auch zu dem Projekt beitragen bedanken: Dominic Swinton (Grün Fuels), Thomas Lowery (Grün Fuels), Sam Buekenhout (Capax) und Sylvia Drouven (Capax).

Materials

Name	Company	Catalog number	Comments
Trizol reagent	Invitrogen	15596-026
Chloroform	Merck	102445
Ethanol	Merck	101986
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
TURBO Dnase	Invitrogen	AM2238
RNA 6000 Nano Kit	Agilent	G2938-90034
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes	Eppendorf	0030 120.086, 0030 120.094
Steel balls	Geyer Berlin GmbH	VA2mm
Mixer mill MM 300	Retsch	YO-04182-09
Microcentrifuge	Eppendorf	5424

References

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Ruprecht, C., Tohge, T., Fernie, A., Mortimer, C. L., Kozlo, A., Fraser, P. D., Funke, N., Cesarino, I., Vanholme, R., Boerjan, W., Morreel, K., Burgert, I., Gierlinger, N., Bulone, V., Schneider, V., Stockero, A., Navarro-Aviñó, J., Pudel, F., Tambuyser, B., Hygate, J., Bumstead, J., Notley, L., Persson, S. Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry. J. Vis. Exp. (87), e51393, doi:10.3791/51393 (2014).