Био-слой интерферометрии для измерения кинетики белок-белковых взаимодействий и аллостерические лиганда Effects

Белок-белковые взаимодействия важны для многих биологических процессах, и метка свободной оптические методы, такие как поверхностного плазмонного резонанса (SPR) были использованы в пробирке для исследования кинетики связывания и диссоциации ^1. Большинство этикеток без методы иммобилизации один биомолекулы на поверхности датчика и использовать оптический сигнал для обнаружения связывающего партнера из раствора, как это связывает с иммобилизованным биомолекулы ^1. В то время как SPR является высоко чувствительным методом, он склонен к помехам из-за изменений показателя преломления раствора, протекающего через датчик ^2. Хотя это и не так чувствительны, как SPR, Био-слоя интерферометрии (BLI) менее подвержен влиянию изменений в образец композиции ^1,3. BLI использует волоконно-оптические биосенсоры, которые имеют собственный биосовместимого покрытия на кончике. Система, используемая здесь (Октет-RED96) содержит восемь спектрофотометры. Белый свет подается по трубам к ряду зондов, которые перемещаются на робота-манипулятора. Оптоволоконные датчики арэ подхвачена зондов и переехал в 96-луночный планшет с образцами. Одна из молекул-мишеней иммобилизуют на поверхности биосенсора. Тогда датчики перемещаются в лунки, содержащие привязки партнера в растворе. BLI контролирует ассоциацию связывающим партнером с иммобилизованным молекулы, а затем контролирует диссоциации после переезда датчиков к решению без обязательного партнера. Связывание молекул на поверхность биосенсора приводит к изменению оптической интерференции между световыми волнами, которые отражают обратно в спектрофотометров от внутренней поверхности и от внешнего интерфейса между датчиком и раствора. Эти изменения в помех может быть количественно и используется для определения кинетические показатели связывания и диссоциации, как показано в анимации, показанной на фиг.1.

Мы применили BLI измерить взаимодействие между каталитического комплекса бактериальной АТФ-синтазы и его ε-субъединицы, которая может автоматически ингибируют фермент. АТФ сиnthase является мембрана встраиваемый поворотный наномотор, который катализирует синтез и гидролиз АТФ ^4. Каталитический комплекс (F ₁₎ может быть выделено в растворимой форме, который работает в качестве АТФазы. Субъединицы ε имеет два домена: N-концевой домен (NTD) необходим для правильного монтажа и функциональной соединение фермента, но не взаимодействует непосредственно с каталитическими подразделений; С-концевой домен (CTD) может ингибировать фермент, взаимодействуя с несколько каталитические субъединицы ^5,6. Эта норма ε-опосредованной специфичен для бактериальных АТФ-синтазы и не наблюдается в митохондриальной гомолога. АТФ-синтаза стала мишенью для антибактериальных препаратов, как показывает недавнее утверждение FDA из bedaquiline для лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза ^7. Таким образом, таргетинг тормозящее роль ε не соответствует лекарственных препаратов может дать антибактериальные, которые не угнетают митохондриальную АТФ-синтазы. С изолированной каталитического комплекса (F _1), εстановится разъединимый субъединицы. Тем не менее, с ε, связанного с F _1, εCTD может пройти значительное конформационные изменения, частично вставки в центральной полости фермента и формирование тормозное состояние, который вряд ли отделить непосредственно ^6,8. Мы используем BLI для измерения кинетики F ₁ / ε связывания и диссоциации, так и косвенно, изучить аллостерические эффекты каталитического сайт лигандов на конформации ε в.

В нашей системе ε была выбрана для иммобилизации на поверхности датчика с сигналом BLI (например, SPR) чувствителен к массе молекул связывания на поверхности. Ε-субъединица является малым (~ 15 кДа) относительно основного F ₁ комплекса (~ 347 кДа). Таким образом, большее сигнал BLI будет результатом связывания F ₁ с иммобилизованным ε. В целях мониторинга F ₁ диссоциации, которая может быть очень медленным, ε должны сильно обездвижен. Таким образом, мы приняли решение biotinylateИ иммобилизации его на покрытых стрептавидином биосенсоров. Белки могут быть биотинилированного по формуле (I) случайной модификации поверхностных лизина ^9, (II) реакции уникальной собственном или инженерии цистеина с биотин-малеимид реагента ¹⁰ или (III) генетически добавление определенного биотин-акцепторных пептид, который ферментативно биотинилированного в течение в естественных условиях экспрессии меченых белков ^11. В нашей системе ε биотинилируют методом (III) ^8. После того, как биотин-меченый ε обездвижен на датчики стрептавидином, BLI может измерить связывание и диссоциация F _1, который был обедненный субъединицы ε (F ₁ (-ε)). Для экспериментов, описанных здесь, предварительные анализы были сделаны, чтобы определить разумные объемы биотинилированной белка для иммобилизации на датчиках. Это может варьироваться в зависимости от молекулярной массы белка и его партнером по связыванию, но цель состоит в том, чтобы определить минимальное количество иммобилизованным белком тшапка обеспечивает (I) приемлемый сигнал-шум для связывания кинетики с низкой концентрацией партнером по связыванию (ниже K _D) и (II) минимальным искажением кинетику связывания с почти насыщение концентрации партнером по связыванию. Кроме того, стехиометрия биотинилирования могут различаться (но избежать> 1 моль биотин / моль белка), так что некоторые начальная анализа могут быть необходимы для каждого нового большого количества биотинилированного белка для подтверждения, что последовательный сигнал BLI может быть достигнуто в течение иммобилизации на покрытых стрептавидином датчики.