Il corneale MICROPOCKET Assay: Un modello di angiogenesi nel Eye mouse

Il processo di angiogenesi, la formazione di nuovi vasi sanguigni formano quelle preesistenti, è molto complesso ed è regolato da diversi fattori endogeni che controllano le diverse fasi di germinazione nave e morfogenesi. L'angiogenesi è attivato a causa di un cambiamento di equilibrio tra fattori pro e anti-angiogenici, un equilibrio che mantiene normalmente la vascolarizzazione in stato di quiescenza. Angiogenesi negli adulti si verifica in determinate condizioni fisiologiche, come durante il ciclo ovarico femminile o nei processi di riparazione come la guarigione delle ferite e la rigenerazione dei tessuti. Tuttavia, è anche una caratteristica di molte patologie tra cui tumori, malattie autoimmuni e malattie infiammatorie. Il coinvolgimento di angiogenesi in queste condizioni fisiologiche e patologiche rende un tema importante per la ricerca e un bersaglio attraente per la terapia.

A causa della complessità di angiogenesi e il coinvolgimento di vari ceLLS e fattori nel processo, comprese le cellule endoteliali, periciti, cellule circolanti e cellule stromali, in vitro modelli restano limitate e non possono ricapitolare il microambiente unico in vivo. Il principale test in vitro di angiogenesi sono in gran parte concentrati sull'osservazione effetti diretti sulle cellule endoteliali e misurare alcuni passi nel processo angiogenetico in condizioni controllate. Questi test includono la quantificazione della proliferazione delle cellule endoteliali ^{1, 2} migrazione, formazione rete ^3, la formazione del tubo ⁴ e germinazione da sferoidi ^5. Ex vivo i modelli, a differenza di quelli in vitro, sono più complessi e integrare più tipi di cellule dei tessuti, un esempio è il test dell'anello aortico ^6. Tuttavia, come altri sistemi, non può catturare il contributo delle cellule circolanti e lo stroma naturale delle cellule endoteliali come esiste in vivo. Tentatividi studiare l'angiogenesi in condizioni di flusso per imitare l'impostazione in vivo vengono eseguite con sistemi microfluidici ^7, tuttavia anche questi test, anche se molto migliorata, sono ancora in grado di spiegare tutti i comparti esistenti in vivo.

A causa delle limitazioni del ex vivo in modelli angiogenesi in vitro e in vivo modelli rimangono le scelte più affidabili per Studi angiogenesi. Esempi di questi modelli includono l'impianto di camere trasparenti, "finestre", che consentono la visualizzazione di crescita dei vasi sanguigni sotto il microscopio ^8, impianti sottocutanei iniettabili come matrigel e vaso formazione nei tessuti normali come mouse orecchio e la membrana corioallantoidea pollo (CAM ). Tuttavia, uno dei modelli di angiogenesi più accettabili e quantitativi in vivo è il test MICROPOCKET neovascolarizzazione corneale qui descritta, che sfrutta la natura avascolarecornea come "schermo" per visualizzare e valutare la nuova crescita angiogenico ^9.

Qui si descrive il test MICROPOCKET corneale come sviluppato nei topi. Inizialmente il modello è stato utilizzato per misurare non specifici stimoli angiogenici in cornee di coniglio. Ciò è stato fatto introducendo pezzi tumorali nell'umore acqueo della camera anteriore dell'occhio di coniglio e misurato neoplastica neovascolarizzazione ^11.

Tuttavia, il test è stato successivamente evoluto per studiare gli effetti di specifici fattori di crescita ¹⁰ per specificare e standardizzare l'effetto angiogenico meglio. Al fine di rilasciare il fattore di crescita nell'occhio, pellet lento rilascio contenenti quantità note di fattori di crescita angiogenici sono stati usati al posto dei tessuti. La disponibilità di proteine ​​purificate ricombinanti angiogenici come il bFGF e VEGF attivato il loro uso come obiettivi specifici di modulaters angiogenesi ^12. Inizialmente, il test è statoin gran parte utilizzato nei conigli, che sono più facili da lavorare con causa delle loro dimensioni, ma in seguito il modello è stato tradotto in topi; un modello animale più piccolo e meno costoso. Il passaggio da coniglio topi fornito un importante vantaggio di poter utilizzare animali geneticamente manipolati, creando così una nuova area di ricerca sulle componenti genetiche che influenzano l'angiogenesi ^13. Oltre all'utilizzo più accettabile di dosaggio cornea nello studio angiogenesi, altri processi biologici possono anche indagati mediante saggi modificati. Ad esempio, gli studi di linfoangiogenesi sono stati resi possibili attraverso l'impianto di pellet a basso dosaggio bFGF che hanno permesso la visualizzazione dei vasi linfatici attraverso marcatori molecolari specifici ^14. Inoltre, questo test ha fornito un mezzo per valutare gli effetti delle radiazioni sulla angiogenesi ^15.

In somma, la corneale test MICROPOCKET angiogenesi è una quantitativa, rappresentanteroducible, la valutazione flessibile di angiogenesi in vivo. Uno dei principali vantaggi di questo test è che la misurazione delle navi di fondo è inutile perché i vasi crescono su un tessuto avascolare naturalmente. Descriviamo qui il protocollo di questo saggio nei dettagli e discutere diversi scenari che possono verificarsi. Il test consiste di 3 segmenti discreti. Qui descriveremo la preparazione di crescita pellet fattore-inclusive, il successivo impianto chirurgico e, infine, il metodo utilizzato per quantificare la crescita neovascolare risultante.