Консенсус мозга, полученных Белок, Добыча протокол по изучению человека и мыши мозга Proteome использованием как 2D-Dige и мини 2DE Иммуноблоттинг

Психические и неврологические расстройства составляют 13% от глобального бремени болезней, новые проблемы как патофизиологических механизмов, факторов риска и продромальными биомаркеров должны быть изучены ^1. В соответствии с этой целью, протеомики исследования человеческого мозга стали незаменимыми, чтобы раскрыть молекулярные пути, участвующие в таких процессах, как память, поведение, эмоции и нейронной пластичности, например, не только для физиологического, но и для патологических состояний. Таким образом, использование животных моделей и, в частности трансгенные мыши, приносит широкий спектр возможностей, чтобы имитировать этиологии нейродегенеративных расстройств человека ^2.

Протеомики подходы в настоящее время доступны для того, чтобы выполнить эти новые перспективы в области неврологии. Двухмерным электрофорезом в геле (2DE) является мощным и, вероятно, простой метод, который позволяет сравнивать протеом широкого круга образцов. Кроме того, это такжемощный метод для выделения белка из сложной смеси с целью выявления и дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии. Этот метод по существу состоит в две последовательные стадии: 1) разделения белков в зависимости от их изоэлектрической точки (PI) по изоэлектрофокусирование (IEF). Точнее, электрический потенциал создают на акриламидных полос immobiline среди градиентом рН, а затем белки будут мигрировать и сосредоточиться на определенной интерфейса в зависимости от их глобальной сети бесплатно. 2) изоэлектрически ориентированные белки денатурируют и отрицательно заряженные добавлением додецилсульфата натрия (SDS), в результате чего белки в их первой структуры разделены в зависимости от их кажущейся молекулярной массой (Mw) в ДСН-ПААГ ^3. Эти два различных свойства позволяют нам решать двойное значение пойти дальше в изучении протеома. С одной стороны, этот подход дает возможность выполнить количественный анализ с использованием метода минимальные красители 2D-Dige, а с другой стороны КАЧЕСТВЕННЫХэ анализ мини-2DE соединен с вестерн-блоттинга.

Количественный анализ по 2D-Dige дарует экспрессии белка меняется во всем образца протеома. Вкратце, пробы помечены трех цианинов (CY2, Cy3 и Cy5), излучающих на трех различных длин волн (синий, зеленый и красный). Эти минимальные Fluor красители, содержащие N-гидрокси группу сукцинимидил эфира реагирует с ε-аминогруппой лизина остатков белков в результате чего ковалентных амидных связей ^4. Остатков лизина помечены только между 1-3% и таким образом предотвращая несколько ярлыков дополнительно за белка и серьезные изменения суммарного заряда ^{5, 6.} Су3 и Су5 часто используется для обозначения двух независимых выборок в то время как Су2 теги сочетание равной пропорции образцов для сравнения. Два основных преимущества, что все меченые образцы смешиваются и МЭФ и SDS-PAGE осуществляются в одном геле сразу для каждого шага, избегая среди вариабельность экспериментов из-за Гели сравнение. Кроме того, он представляет высокий порог обнаружения составляет около 1 femtomole белка ^7. Гели сканируются и 2D программное обеспечение сравнивает 2D флуоресцентные изображения гель, где Cy2 служит в качестве внутреннего стандарта, позволяющего для идентификации статистических различий между местами для их идентификации задней методом масс-спектрометрии. Программное обеспечение 2D анализ с использованием внутреннего стандарта достигает быстрое обнаружение менее 10% различий между образцами с более чем 95% от статистической достоверности ^8.

Качественный анализ по мини-2DE является важным шагом для белка характеристики. Принцип такой же, как было описано ранее для пи и разделения МВт, но в этом случае белки передаются из небольшого полиакриламидном геле с мембраной и иммуноблоттинга выполняется после этого. В то время как один электрофорез измерение гель обеспечивает изменения в экспрессии белка для одного или нескольких белковых эпитопов в зависимости от антитела, в ИНФОРМАЦИЯн мини-2DE наделяет двух дополнительных параметров. Во-первых, белковые isovariants изменяться в зависимости от ПИ, указывая, что посттрансляционные модификации может иметь место. Во-вторых, масса спектрометрия идентификация может свидетельствовать о возможных зимогенов и катаболических продуктов белков. Таким образом, изменения, наблюдаемые 2D-Dige, скорее всего, свидетельствует о механизмах, лежащих в основе изменений в глобальной профиль протеома. Трассы из иммуноблотах среди нескольких образцов за тот же белок эпитопной / с по мини-2DE может отражать кислотности изменения проливают свет на пост-трансляционных изменений немного, наблюдаемых или даже не monodimensional иммуноблотинга ^{9, 10.} Кроме того, этот анализ информирует о потенциальных сайтов расщепления из-за ведома ИП и МВт метаболических остатков ^11,12.

Сочетание этих двух методов обеспечивает дополнительный анализ протеомики. С одной стороны 2D-ПГЛП дает А типэ различий, позволяющих точное выделение полипептидов, экспрессия которых отличается. Эти различия состоят в основном в появления или исчезновения пятна или увеличения / уменьшения интенсивности данной одного программным обеспечением анализа флуоресцентных гелей. Тем не менее, эти наблюдения сами по себе вряд ли объяснить природу модификации наблюдается. По этим причинам, как только полипептид выделен и идентифицирован методом масс-спектрометрии, использование мини-2DE позволяет точно подтвердить 1) личность белка, выделенного и 2) характер разницы: изменение в уровне изовариантным / изоформы Выражение, пост-трансляционные модификации и процессы расщепления например. Тем не менее, необходимо разработать начальный лизирующего буфера и совместимый с 2D-Dige и с мини-2DE того, чтобы ограничить возможные дисперсий в результате использования экстракции протоколов, которые очень различны.

В настоящей статье мы деописано адаптированный протокол для подготовки, добычи и выполнения 2D-Dige и методов мини-2DE для белков мозга, поступающих из человека и мыши ткани.