Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell'uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Disturbi mentali e neurologici rappresentano il 13% del carico globale di malattia, nuove sfide come meccanismi fisiopatologici, fattori di rischio e biomarcatori prodromici devono essere esplorate ^1. In linea con questo obiettivo, proteomica studi del cervello umano diventano indispensabili per scoprire i meccanismi molecolari coinvolti nei processi come la memoria, il comportamento, le emozioni e la plasticità neuronale per esempio, non solo per motivi fisiologici, ma anche per le condizioni patologiche. Pertanto, l'uso di modelli animali e più specificamente i topi transgenici, porta una vasta gamma di possibilità di imitare l'eziologia delle malattie neurodegenerative umane ^2.

Proteomica approcci sono oggi disponibili per realizzare queste nuove prospettive nel campo delle neuroscienze. Gel elettroforesi bidimensionale (2DE) è un metodo semplice e potente probabile che permette di confrontare il proteoma di una vasta gamma di campioni. Inoltre, è anche unpotente metodo per isolare una proteina da una miscela complessa al fine di identificare e analizzare ulteriormente mediante spettrometria di massa. Questa tecnica consiste essenzialmente in due fasi successive: 1) la separazione delle proteine ​​in base al loro punto isoelettrico (pI) da isoelettrofocalizzazione (IEF). Più precisamente, un potenziale elettrico viene applicato attraverso le strisce di acrilammide Immobiline tra un gradiente di pH e quindi proteine ​​migreranno e concentrarsi su un pI determinata in funzione della loro carica netta globale. 2) proteine ​​Isoelectrically focalizzati sono denaturati e caricati negativamente con l'aggiunta di sodio dodecil solfato (SDS), in tal modo le proteine ​​nella loro prima struttura sono separati in funzione del loro peso molecolare apparente (MW) mediante SDS-PAGE ^3. Queste due proprietà distinte ci permettono di affrontare un valore doppio di andare oltre nello studio del proteoma. Da un lato questo approccio offre la possibilità di effettuare una analisi quantitativa utilizzando coloranti minime metodo 2D-DIGE, e dall'altro un qualitative analisi mini-2DE accoppiato al western blotting.

Analisi quantitativa da 2D-DIGE conferisce espressione della proteina cambia tutto il proteoma del campione. In breve, i campioni vengono etichettati con tre cianine (CY2, Cy3 e Cy5) che emettono a tre lunghezze d'onda distinte (blu, verde e rosso). Questi coloranti minime fluor contenenti N-idrossi gruppo estere succinimidyl reagiscono con il gruppo ε-amminico lysines residui di proteine ​​conseguente covalenti legami ammidici ^4. Residui di lisina sono etichettati solo tra 1-3% e impedendo così più etichette, oltre a proteine ​​e importanti modifiche di carica al netto ^{5, 6.} Cy3 e Cy5 sono spesso utilizzati per etichettare due campioni indipendenti mentre Cy2 tag un mix di uguale percentuale dei campioni da confrontare. I due vantaggi principali sono che tutti i campioni etichettati sono miscelati e IEF e SDS-PAGE sono svolte in un gel in una sola volta per ogni passo, evitando l'inter variabilità tra esperimenti a causa di gel confronto. Inoltre, presenta una soglia alta rilevamento di circa 1 femtomole di proteine ^​​7. Gel vengono analizzati e software 2D a confronto le immagini 2D fluorescenza gel, dove Cy2 serve come standard interno consentendo l'identificazione delle differenze statistiche tra i punti per la loro identificazione posteriore mediante spettrometria di massa. Il software di analisi 2D utilizzando lo standard interno raggiunge un rilevamento rapido di meno del 10% delle differenze tra i campioni con più del 95% di confidenza statistica ^8.

Analisi qualitativa da mini-2DE è un passo cruciale per la caratterizzazione delle proteine. Il principio è lo stesso come precedentemente descritto per pI e separazione MW, ma in questo caso le proteine ​​vengono trasferite da una piccola gel di poliacrilammide ad una membrana e immunoblotting viene eseguita dopo. Mentre una elettroforesi su gel di dimensione fornisce cambiamenti nell'espressione di proteine ​​per uno o più epitopi proteici in funzione della anticorpo, il information di mini-2DE dota di due parametri aggiuntivi. In primo luogo, le isovariants proteine ​​cambiano in funzione del pI, indicando che modificazioni post-traduzionali potrebbero aver luogo. In secondo luogo, l'identificazione spettrometria di massa può essere indicativo di zimogeni plausibili e prodotti catabolici di proteine. Pertanto, le modifiche osservate da 2D-DIGE sono probabilmente indicativi dei meccanismi alla base cambiamenti nel profilo proteoma globale. Allineamenti di immunoblots tra i diversi campioni per la stessa proteina epitopo / s in mini-2DE possono riflettere i cambiamenti di acidità che faccia luce sulle variazioni post-traslazionali leggermente osservate o addirittura non da immunoblotting monodimensionale ^{9, 10.} Inoltre, questa analisi informa circa i potenziali siti di taglio dovuti alla conoscenza del pI e MW dei residui metabolici ^11,12.

La combinazione di queste due tecniche fornisce un complementare analisi proteomica. Da un lato 2D-DIGE offre un tipicoe di differenze che permettono un isolamento precisa di polipeptidi la cui espressione è diversa. Queste differenze consistono essenzialmente nella comparsa o scomparsa di un punto o di aumento / diminuzione dell'intensità di un dato da una analisi software dei gel fluorescenti. Tuttavia, queste osservazioni da soli sono difficilmente spiegare la natura della modifica osservato. Per queste ragioni, una volta che il polipeptide è isolato e identificato mediante spettrometria di massa, l'uso di mini-2DE permette di confermare precisamente 1) l'identità della proteina isolata e 2) la natura della differenza: variazione del livello isovariant / isoforma espressione, modificazioni post-traslazionali e processi di scissione per esempio. Tuttavia, è necessario sviluppare un tampone di lisi a partire sia compatibile con 2D-DIGE e mini-2DE per limitare i potenziali dispersioni derivanti dall'uso di protocolli di estrazione che sono molto dissimili.

Nel presente articolo, DEdescritto un protocollo adattato per la preparazione, estrazione e prestazioni delle tecniche mini-2DE per proteine ​​cerebrali provenienti da tessuti umani e mouse 2D-DIGE e.