Hipokampal Dilimleri adlı CA1 Nükleer Zenginleştirilmiş Kesirler izolasyonu Synapto-nükleer Messenger Proteinler Etkinliği-bağımlı Nükleer İthalat Okuyacak
Summary
Biz, hipokampusun CA1 bölgesinde ve dilimin tetanized alan nükleer zenginleştirilmiş kısımların daha sonraki izolasyon Uzun süreli potansiyasyon indüksiyonu için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yaklaşım, önemli aktivitesini öğrenme ve hafıza ile hücresel modellerinde bağımlı nükleer protein alma belirlemek için kullanılabilir.
Abstract
Öğrenim aktivitesine bağlı protein ekspresyonu, hücre-altı yer değiştirmesi, ya da fosforilasyon sinaptik plastisite altında yatan hücresel mekanizmaların anlaşılması önemlidir. Uzun vadeli potansiyelleri (LTP) ve akut hipokampal dilim bağlı uzun süreli depresyon (LTD) yaygın öğrenme ve hafızanın hücresel modelleri olarak kabul edilir. Etkinlik bağımlı protein dinamikleri görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme veya immünohistokimya yaklaşımları kullanmak birçok çalışma bulunmaktadır. Bununla birlikte, bu yöntemler tek nöronlarda floresan-etiketli proteinlerin immünolojik hücre ya da aşırı dışavurumu için antikorların uygunluğu dayanır. Proteinlerin İmmünoblotting bulguların bağımsız onay veren bir alternatif yöntemdir. Bireysel tetanized hipokampal dilimlerde sub-hücresel fraksiyonları hazırlanmasında ilk sınırlayıcı faktör, malzemenin düşük miktarıdır. İkinci olarak, işleme yöntemi çok önemlidir l, hatta çok kısa bir küçük ve manipülasyon içindilimleri Iving belirli sinyal silsileleri uyarmamaktadır olabilir. Burada fare beyninden akut hippokampüs kesitlerinin CA1 bölgesinde yeterli saflıkta nükleer bakımından zengin kısım için yeterli malzeme elde etmek için bir optimum iş akışını açıklar. Temsili bir örnek olarak, synapto-nükleer protein haberci ERK1 / 2 fosforlu şekli Jacob aktif LTP indüksiyonu üzerine çekirdeğe doğru yer değiştirir ve CA1 nöronlarının bir nükleer bakımından zengin kısım tespit edilebileceğini göstermektedir.
Introduction
Sinaptik N-metil-D-aspartat-reseptörler (NMDARs) sinaptik plastisite ve hücre hayatta kalma ve nörodejenerasyonunun hücre ölümünü nasıl tetikleyebildiği extrasynaptic NMDARs aktivasyonu ise sinyal çok önemli bir rol oynar. Bu değişiklikler sıkı kontrol / düzenlenmiş bir faaliyet bağımlı gen ifadesine bağlı ve böylece aktif sinaps veya dendritler ve nükleus 7 arasında sürekli iletişim gerektirir. MAP ERK1 / 2 sinyalizasyon sinaptik NMDARs alt baş gerçekleştirmekle ve extrasynaptic NMDAR yoluyla sinyalleme yapan hiç ya da ERK1 / 2 aktivitesi 8,11 üzerinde inhibe edici bir etkiye sahiptir, oysa, NMDAR-aktivasyonu ile uyarılan gen sentezlenmesine katılan edilir kinaz.
Distal dendrit ve çekirdeği arasındaki transfer gösterilmiştir proteinler vardır. Bu proteinlerin çoğu bir nükleer lokalizasyon sinyali içerir ve aktif olarak çekirdeğe bir 6,9 ve dinein importin bağımlı bir şekilde, mikrotübülün boyunca taşınmaktadır. InterestinglY, belirli bir sinaptik uyarıcıya tepki olarak çekirdeğe Bu taşıyıcı maddelerin bazıları için yalnızca bir geçiş. Örneğin, siklik AMP tepki elemanı bağlayıcı protein 2 (CREB2) retrograd nakil aracı kimyasal LTD, fakat LTp 12 tarafından indüklenir. Lokalize NMDAR-bağımlı uyarma sinaptik uzun vadeli plastisite hipokampal 4 katılır çekirdeği, bir translokasyon süreç içine CREB düzenlenmiş kopyalayıcı ortak aktifleştirici (CRTC1) tahrik eder. Son zamanlarda protein haberci Jacob hem sonra nükleus, sinaptik ve extrasynaptic NMDAR aktivasyonu için translocates ve CREB'ye bağımlı gen transkripsiyonunu 5 düzenler olduğu gösterilmiştir. Sinyalinin sinaptik veya extrasynaptic kökenli Jacob bir sonrası modifikasyon kodlanmıştır. Sinaptik aktivitesi primer hipokampal kültürdeki çekirdeğe translokasyonu açısından daha sonra gerekli bir konumda olan 180 (pJacobS 180) açısından çok önemli bir serin bir Yakup'un ERK1 / 2 bağımlı fosforilasyonunu uyanr. Ayrıca, in CA1 Schaffer kollateral LTP sonra çekirdeğe akut hipokampal dilimlerin pJacobS 180 translocates nöronlar değil 1,10 LTD. pS180 Jacob plastisite ilişkili genlerin ifadesindeki artışa neden olur ve bu gen ekspresyon sinaptik fonksiyon geri beslenir. Extrasynaptic NMDARs aktivasyon Ser180 fosforilatlanır değildir ve neden çekirdekte farklı bir protein kompleksi ile ilişkili olabilir sonra çekirdeğe translocates tezat, Jacob 'CREB'ye kapatmak' ve sinaptik bağlantıları 10 bir geri çekilme.
Synapto-nükleer protein haberci nükleer ithalatına En yayınlanan çalışmalar, ayrışmış nöronal primer kültürlerinde yapılmıştır. Nöronal bağlantı ve fonksiyon çok daha iyi korunmuş olduğu, bu nedenle bu bulgular hipokampal dilimleri kullanarak fizyolojik daha uygun koşullar çoğaltılamaz görmek ilginç olacaktır. Burada LTP-de değerlendirmek için optimize edilmiş bir protokol mevcutimünoblotlama protein haberciler nükleer translokasyonunu pendent. Bu yöntem aynı zamanda bu basit bir nükleer fraksiyonda proteinin aktivitesine bağlı fosforilasyonunun analizi için uygundur. Özel olarak, mevcut protokolü akut, CA1, hipokampüse ait kesitler indüksiyonu ve LTP kayıt hazırlanmasını da kapsar. Sonraki CA1 bölgesi mikroskobik uyarılmış bölgeyi izole etmek için disseke edilir. Biz kombine ve Zhao ve arkadaşları 17 tarafından tanıtılan değişiklikler ile CellLytic nükleer Ekstraksiyon Kiti tarafından sağlanan nükleer izolasyonu için protokol değiştirilmiş. Optimize edilmiş prosedür, hücre şişmesi ve çekirdekler salımını sağlayan, hipotonik tampon maddesi içinde kesildi CA1 bölgelerin lızız ışlemını içermektedir. Hücre lizizi, ve çekirdekler morfolojisi mikroskopik inceleme ile tespit edilebilir. Nükleer zenginleştirme kısa bir santrifüjleme adımı ile elde edilir. Neun ve NSE2, nükleer veya sitosolik fraksiyonlar özel markörler, karşı antikorlar ile immunoblotting analizi bu yaklaşım hızlı bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedirve tekrarlanabilir protokolü bu hücrealtı kesirler izole etmek ve protein fosforilasyonu gibi çok kararsız öteleme sonrası modifikasyonları çalışma. Buna ek olarak, bu yöntem, hipokampal dilimler kesilmiştir CA1 bölgelerinden kaynaklanan küçük bir doku numuneleri için avantajlıdır ve hipokampal dilimler immünohistokimya ile kombinasyon halinde de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki protokolün açıklanan adımlar, hipokampus akut genç ya da yetişkin farelerin dilimlenmiş hazırlamak dilim uyarılmış alanı neden ve kayıt LTP, hızla teşrih ve aktivite bağımlı protein dinamikleri incelemek için nükleer zenginleştirilmiş kısmını hazırlamak için nasıl rehberlik sağlamak. Bu yaklaşım, her biri birbirinden bağımsız bir şekilde kullanılan birçok farklı yöntemlerin kombinasyonu kaynaklanmaktadır. Biz bir iş akışını optimize edilmiş ve LTP indüksiyonu ü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP grant (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK and SB), MM is a recipient of European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) and Marie-Curie IEF.
Materials
| Table 1. Equipment | |||
| CED 1401 AD/DA converter | Cambridge Electronics Design, UK | ||
| Axopatch 200B amplifier | Axon，USA | ||
| Axon Digidata acquisition system | Axon，USA | ||
| Clampex 10.0 Data acquisition and analysis software | Axon，USA | ||
| Leica microscope | Leica TCS SP2，Germany | ||
| P-97 Standard microelectrode puller | Sutter，USA | ||
| Stereomicroscope | Leica | Leica S4E, Germany | |
| Vibrotome | Leica VT1000S, Germany | ||
| Isolated pulse stimulator | Model2100, A-M systmes, USA | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, HERAEUS, FRSCO17 | ||
| SDS-PAGE system | BIORAD | ||
| Cooler | JULABO | ||
| Bright field Microscope | NIKON ECLIPSE TS100 | ||
| Cell culture incubator | Thermo Electron Corporation, HERAEUS | ||
| Micromanipulator | Luigs & Neumann, SM-5, Germany | ||
| Blotting chamber and electric power supplier | Hoefer Scientific Instruments, San Francisco | ||
| Cooler | Julabo, F12 | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific, Heraeus, FRESCO 17 | ||
| Submerged type Recording Chamber | custom made | ||
| U-shape and submerged type incubator | custom made | ||
| Small surgical scissors | |||
| Scalpel | |||
| Thin spatula | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Plastic culture dish | |||
| Bunsen beaker | |||
| Syringe | |||
| Table 2. Reagents | |||
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| NaCl | ROTH | Art.-Nr.3957.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| KCl | ROTH | Art.-Nr.6781.1 | ≥99.5%, p.a.,ACS,ISO |
| CaCl2·2H2O | MERCK | 1.02382.0500 | pro analysi |
| MgSO4·2H2O | MERCK | 5886.05 | pro analysi |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946 | for Molecularbiology |
| KH2PO4 | MERCK | 12034.025 | for Molecularbiology |
| Na2HPO4·2H2O | MERCK | 1.06574.1000 | extra pure |
| Glucose·H2O | ROTH | Art.-Nr.6887.1 | for Molecularbiology |
| Hepes | ROTH | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, ≥99.5%, p.a. |
| NaHCO3 | MERCK | 1.06329.1000 | pro analysi |
| Protease inhibitor Coctail | ROCHE | ||
| Phosphostop | ROCHE | ||
| Bicuculline | Tocris bioscience | ||
| Isofluran | Baxter | ||
| Table 4. Antibodies | |||
| Primary antibodies | Company | Catalog Number | Species |
| pJac-s180 | Biogenes/ purified | rabbit (dil. 1:100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | mouse (dil. 1:1,000) |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | rabbit (dil. 1:1,000) |
| beta-actin | Sigma | A-5441 | mouse (dil. 1:5,000) |
| Secondary antibodies | Species | ||
| IgG HRP Conjugated | DAKO | goat anti – mouse (1:5,000) | |
| IgG HRP Conjugated | NEB | goat anti – rabbit (1:5,000) |
References
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276 (2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation. 神经科学. 169 (4), 1520-1526 (2010).
- Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters. Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).
- Ch’ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O’Dell, T. J., Martin, K. C. Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus. Cell. 150 (1), 207-221 (2012).
- Dieterich, D. C., et al. Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus. PLoS Biol. 6 (2), e34 (2008).
- Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. From synapse to nucleus and back again–communication over distance within neurons. J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).
- Hardingham, G. E., Bading, H. Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders. Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).
- Ivanov, A., et al. Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons. J. Physiol. 57, 789-798 (2006).
- Jordan, B. A., Kreutz, M. R. Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling. Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking. Neuron. 46, 745-760 (2005).
- Lai, K. O., Zhao, Y., Ch’ng, T. H., Martin, K. C. Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures. 神经科学. 131 (3), 601-610 (2005).
- Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve. Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).
- Xiang, Z., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).
- Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation. J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).
