ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

血液細胞の生体エネルギーを評価するために、全血をEDTAまたはACDバキュテナーコレクションチューブに静脈穿刺によりヒト被験体から採取される。採血以下の白血球および血小板の単離は、プロトコルに詳述されるように、図1Aに視覚化される。全血サンプルは、細胞死および活性化を避けるために、コレクションの8時間以内に処理される。 8時間よりも大きな拡張記憶時間がテストされていませんが、変更された生体エネルギーをもたらし、生理学的条件のあまりを表すことができる。クエン酸デキストロース（ACD-8 ml）およびEDTAバキュテナーチューブは、単離された細胞の生体エネルギー機能に無影響で細胞単離のために使用されている。血餅は、得られた細胞の数を減らすフィコール勾配遠心分離中に適切な相形成を妨害し、遠心分離し、血清で得られていない血小板をほとんどもたらすような抗凝固薬が必要である。すべての血液はBIOLOGを表しiCalの有害性と、適切な個人用保護具は、細胞集団が隔離されているか、細胞溶解物が生成された後でも、全体の手順全体に実装されなければならない。サンプルは、金融機関の人間の廃棄物処理基準に従って処分しなければならない。 全血バフィーコート白血球を含有するだけでパックされた赤血球前記白色層から多血小板血漿を分離するために遠心分離される。バフィーコートは、密度勾配に適用し、末梢血単核細胞（単球およびリンパ球）および多形核細胞（顆粒球）を得るために遠心分離する。個々のMNCおよびPMN細胞相の赤血球汚染は、この段階では一般的であり、MACS精製の間に解決しなければならない。種々の細胞型は、その後、純粋な画分を得るために、磁気抗体とのインキュベーションにより得られる。単球は、CD14、フロースルーからtでPBMC画分のインキュベーションによって収集される彼はその後、赤血球および血小板の枯渇しているリンパ球を、含まれている単球。好中球は、CD15抗体（ 図1A）を有する多形核細胞層をインキュベートすることによって得られる。その後、血小板は、多血小板血漿の遠心分離によってペレット化し、他の血漿成分を除去するために洗浄することができる。これらの選択の後に血小板は、CD14 +単球、リンパ球は、CD15 +好中球は生体エネルギー及び酸化的バースト分析のための細胞接着媒体でコーティングされたXFのアナライザ·プレート上で計数し、めっきすることができる。 手順の各ステージは、無菌条件下で行われるべきであり、単球および好中球の酸化的バースト応答の早期活性化を防止することが奨励される。基礎条件で、酸素消費量にはほとんどを持っている好中球は、上昇したOCRの測定と細胞外フラックスアッセイを開始するときに、分離中に無菌条件未満の指標は明らかである徐々に増加またはアッセイ全体で減少となりました。私たちは、活性化の形態学的兆候は、アッセイの前に発生していないことを確実にするために200X以上に光学顕微鏡を用いて細胞を画像化することの重要性を強調している。 図1Bに示すように、例えば、好中球は、通常、顕著な細胞境界を有する不規則な形状に丸みを表示する。しかしながら、これらの細胞が活性化されると、プレートの表面に対して平坦化及びその別個の細胞形態を失うことになる。我々は以前、このプロトコルを使用して活性化白血球や血小板の形態変化を報告しているし、追加的な措置は、アクティベー8に遭遇した場合は、無菌状態を確保するために注意する必要があります。 プロトコルの単純化されたスキームは、細胞分離、XFプレート調製およびXFアッセイの主要なステップが詳述されたタイムテーブルとして図2に示されている。単離は、細胞型の密度勾配分離で構成され、磁気分離が続く。細胞分離工程に平行な、XF板製剤は、細胞又はめっきXFアッセイ開始の遅延を回避する必要がある。大幅な遅延が細胞の活性化と減少生体エネルギーのパラメータにつながる可能性があるため、これは非常に重要です。 単離後の不十分な細胞濃度は、一般的な問題は、各遠心分離プロセスの最適化は、細胞の損失を避けるために必要である。成功した単離は、血液のわずか6などの溶液に対して実施されたが、変化は、所望の細胞型の循環濃度に応じて行うことができる。密度勾配が不適切用意されている場合は、異なる細胞相が表示されない可能性があり、細胞の損失が発生する可能性があります（視覚的なデモンストレーション用のJoveの教育ビデオを見てください）​​。 PRPから単離された不十分な血小板はまれであるが、分離は室温以下で行われる場合、洗浄緩衝液は、PGI 2を含有しない場合、または発生している。血小板Aのリスク血小板を単離するための最後のセルである場合には、しばしばctivati​​on防止され、血小板が長時間洗浄バッファーに残っている場合しかし、生体エネルギーが影響を受けることになる。 1500 XGの遠心分離中にペレット化しておらず、これらの細胞の生体エネルギーが広範に特徴付けられていない小さい血小板集団の事例があった。より完全なトラブルシューティングガイドについては、表2を参照してください。 白血球および血小板の生体エネルギープロファイルは、非侵襲的に細胞におけるリアルタイムのO 2消費量を測定するXF分析器を用いて決定することができる。 図3Aに示すように、各セルタイプは、5つの複製を有するXF24プレート上にメッキされる。 表1に示しウェルあたりアッセイおよび平均タンパク質濃度の間に細胞の種類によって期待される基礎および酸化バースト値。高いスループット技術は、が可能になりXF96として、ご利用いただけます図3Bに示すように、4人のドナーを同時に評価することができる。分析した後、データが適切なXFソフトウェアとMicrosoft Excelを使用して分析用のワークステーションコンピュータにエクスポートされます。 OCR値は、対応するウェル中の総タンパク質含有量に対して標準化し、ピコモル/分/ mgタンパク質として表した。各細胞型の代表的な生体エネルギー酸化的バーストプロファイルは、最近我々のグループ8で報告された。先に示した、 図8の下に記載のアッセイ（基底、ATP結合、プロトンリーク、最大、nonmitochondrial及び酸化的バースト）の生体エネルギーのパラメータのさらなる分析は、個々のウェルについて計算することができる。 図4Aに示すように、基礎酸素消費速度（OCR）は第3の測定によって確立される。オリゴマイシン（0.5μg/ mlの）は、ミトコンドリアのATP合成酵素の阻害剤は、OCRがATP合成的表現とに結合された推定するためにXF媒体中に注入する ATP-リンクとしてテッド。残留OCRマイナスnonmitochondrial OCRはプロトンリークに起因することができます。次いで、FCCP脱共役剤は、酸素消費nonmitochondrial源を決定するために、アンチマイシン-A、ミトコンドリア呼吸の阻害剤、続いて、最大のOCRを決定するために添加される。予備容量は、エネルギー需要の下で生産することができ、呼吸の最大速度と基礎との間の差として計算することができるATPの量の尺度である。酸化的バースト能力を決定するために、ホルボール12 -ミリステート13 -アセテート（PMA）PKCアゴニストは、NADPHオキシダーゼ活性を増加させるために注入され、PMA刺激後の酸素消費速度の増加は、XFアナライザーを用いて測定することができる。 図4Bミトコンドリア機能と酸化的バーストの異なるパラメータを計算する方法を示しています。 1301/51301fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg "/> 図1。全血から白血球や血小板の単離。 A）新たに採取した検体を遠心分離によりそれらの血漿および細胞成分に分離し、Ficoll密度勾配により精製し、血小板が高いにより単離している間に磁気活性化細胞は、正（単球及び好中球）又は陰性選択（リンパ球）によって（MACS）でソートされている一度XF DMEM中に再懸濁し、指示された細胞密度でプレーティング単離された細胞集団の高速多血小板血漿を遠心分離する。B）の画像が。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 ghres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg "/> 図2。白血球と血小板の生体エネルギー研究のためのXF24プレートの調製細胞の単離とメッキとカートリッジの潤いと噴射口の読み込み中XF24アッセイプレートを調製するための詳細な時系列。 XF24およびXF96アナライザプレート。A）、白血球（125〜250,000細胞/ウェル）単一ドナーからの血小板（25×10 6細胞/ウェル） に白血球および血小板の図3のレイアウトは、背景のうち、XF24アッセイプレート上にプレーティングされているコントロール。オリゴマイシンの10倍の株式の75μL（0.5μg/ ml）を、FCCP（0.6μM）、アンチマイシンA（10μM）、およびPMA（100 ng / mlのは）XF培地で希釈がにロードされ指示された注入口へ。B）白血球（75-150K細胞/ウェル）、血小板（10×10 6細胞/ウェル）最大4つのドナーが180μlのXF-DMEMの総容量XF96にめっきすることができるから。オリゴマイシンの10倍の株式の20μL（1.0μg/ ml）を、FCCP（0.6μM）、アンチマイシンA（10μM）、およびPMA（100 ng / mlのは）XF-DMEM中で希釈され、示された注入口にロードされます。 ミトコンドリアや単球における酸化的バーストによる酸素消費速度（OCR）の図4。生体エネルギー指標の分析。A）代表トレース。基礎OCRは（円内の数字で示す第3の料金）を設立している。オリゴマイシンのその後の順次追加（O; 0.5μg/ ml）を、FCCP（F; 0.6μM）および抗マイシンA（;10μM）ミトコンドリアおよび非活性化細胞のnonmitochondrial呼吸を決定するために注入される。最後に、PMA（100 ng / mlの）酸化的バーストを測定するために添加される。B）に示すようにモジュラミトコンドリア機能の分析および酸化的バーストは速度の差によって計算される。 最適な播種密度平均。基礎OCR（ピコモルO 2 /分） 平均。酸化的バーストのOCR（ピコモルO 2 /分） 平均。タンパク質濃度（μg）/ウエル単球 250K細胞/ウェル 83.9（13.0±） 300.3（58.8±） 19.0（±2.4） <td height="40"スタイル= "高さ：40pxに;">好中球 250K細胞/ウェル 6.1（2.2±） 1411.8（233.3±） 20.6（±2.7） リンパ球 250K細胞/ウェル 52.9（±7.7） 15（±4.1） 13.2（±2.1） 血小板 25×10 6細胞/ウェル 199.4（20.3±） 24（±2.7） 47.5（±3.1） 表1。 XF24アッセイのための通常のパラメータ：平均基礎（レート3）および酸化的バースト（レート7）OCRはnonmitochondrial OCRまたはタンパク質に補正していないが、示された細胞密度で平板培養細胞の種類によって表示されます。 DC Lowryアッセイによって実行されるウェルあたりの平均タンパク質含有量が示されている。これらのデータは、平均値を表す±SEMを含む括弧で6-8健康なドナー。 ステップ問題考えられる理由ソリューション 1.2 明確なプラズマ遠心分離中にペレット化した血小板 10分の遠心分離時間を短縮するか、400 XGに遅い乳白色のプラズマ過剰な脂質食後のコレクションを避ける 1.6 不完全なセルのバンドが形成される小鬼ローパー勾配の準備、冷たい試薬ピペッティングの際に勾配を中断しないよう、常温試薬を使用セル帯で塊血液の凝固が発生している可能性がこのようなACDまたはEDTAなどの抗凝固剤を用いて血液を収集 1.10 ない細胞ペレットんステップ1.6を​​参照してください。 上澄みはかすん以下を参照した場合かすん上清重フィコール勾配汚染、血小板汚染 900 XGに遠心分離速度を増加させ、ジより多くのRPMIでリュート 1.16、1.17 白血球の低い収率重いRBC汚染、十分ではない全血、凝固二重抗体およびRPMI-BSAボリューム、抗凝固剤を追加し、より多くの血液を収集 1.19 血小板凝集 PGI 2を省略し、冷たいメディア、血漿中の長期保管への暴露血小板の洗浄緩衝液を使用し、室温試薬にPGI 2を追加 1.20 血小板数の低下主な遠心分離、血小板凝集中の紛失見る1.2と1.19ステップ 2.3 RBC汚染 MACS分離を繰り返します 表2。白血球と血小板の分離、トラブルシューティング。表には、全血およびトラブルシューティングのプロセスを使用してユーザーをガイドすることが解決策の白血球と血小板の細胞単離の間に遭遇する一般的な問題を示しています。