Plegable y caracterización de un Robot Bio-sensible de ADN Origami
Summary
DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).
Abstract
El nanorobot de ADN es un dispositivo nanométrico hexagonal hueco, diseñado para abrirse en respuesta a estímulos específicos y presente de carga secuestradas en el interior. Ambos estímulos y carga se pueden adaptar según las necesidades específicas. Aquí se describe el protocolo de fabricación nanorobot de ADN, con el uso de la técnica de origami de ADN. El procedimiento se inicia mediante la mezcla de alimentos básicos de ADN de una sola hebra cortos en una mezcla de valores que se añade a una larga y circular, andamio ADN de una sola hebra en presencia de un tampón de plegado. Un ciclador térmico estándar de está programado para disminuir gradualmente la temperatura de reacción de mezcla para facilitar el recocido-grapas a andamio, que es la fuerza de guía detrás el plegado de la nanorobot. Una vez que la reacción de plegado 60 hr es completa, el exceso de grapas se descartan usando un filtro de centrífuga, seguido por visualización a través de electroforesis en gel de agarosa (AGE). Por último, la fabricación con éxito de la nanorobot es verificado por microscopía electrónica de transmisión (TEM),con el uso de uranilo-formiato como tinción negativa.
Introduction
Los usos de los ácidos nucleicos de la nanotecnología son asombrosos. La maleabilidad de la base de emparejamiento Watson-Crick, así como la facilidad y bajo costo relativo de la síntesis a gran escala de oligonucleótidos medida 2 ha generado una explosión de aplicaciones 3 y la investigación en el campo de la nanotecnología de ADN. Nanotecnología de ADN estructural, basado en el 4,5 unión Seeman inmóvil como un bloque de construcción fundamental hace uso de ADN como una unidad elemental auto-montaje para la construcción de formas arbitrarias 6-8.
El reciente desarrollo de la DNA andamiaje origami 9 técnica permite la construcción de complejos 2D / 3D nano-arquitecturas de 10-12 con una precisión sub-nanométrica y es una vía eficaz para la construcción de nuevos objetos funcionales con el aumento de la complejidad y la diversidad asombrosa. El proceso de construcción se basa en un ADN monocatenario largo andamio, por lo general deriva de una genom virale, que se puede plegar a través de la hibridación de cientos de oligos cortos cadena de ADN individuales denomina grapas. La alta resolución estructural obtenida por esta técnica es el resultado directo de las dimensiones naturales de la doble hélice del ADN, mientras que la reproducibilidad de la fabricación es el resultado de la adaptación de las secuencias cortas de grapas de una sola hebra para facilitar la complementariedad máxima de enlaces de hidrógeno alcanzable. Con el uso de una temperatura de recocido rampa lenta la más baja energía diseñado, termodinámicamente preferido nanoestructura se alcanza en altos rendimientos y fidelidad. La fácil aplicación de las reglas de diseño de unión en un código informático permitió el desarrollo de herramientas CAD, como caDNAno 13, que muy a simplificar la tarea de diseñar estructuras grandes y complejas que contienen cientos de uniones conectadas.
Anteriormente hemos descrito el diseño de un nanorobot de ADN con la ayuda de la herramienta de 14,15 caDNAno. Aquí representan la fabricación yvisualización, a través de microscopía electrónica de transmisión (TEM), de la nanorobot, un nanodispositivo hexagonal hueca 3D, con unas dimensiones de 35 x 35 x 50 nm 3, diseñado para sufrir un cambio conformacional importante en respuesta a un estímulo predeterminados y presente de carga específica, tales como proteínas o ácidos nucleicos oligos, secuestrado en el interior. Mientras que 12 estaciones de carga están disponibles dentro del chasis hueco, el número real de carga con destino diferente con el tamaño de la carga. Moléculas de carga van desde pequeñas moléculas de ADN a las enzimas, anticuerpos y 5-10 nanopartículas de oro nm. Cargocan o bien ser uniforme o heterogénea, de manera que cada nanorobot contiene una mezcla de diferentes moléculas. Sensing se logra a través de dos puertas de bloqueo doble diseño helicoidal para detectar proteínas, ácidos nucleicos u otros productos químicos, basado ya sea en aptasensor 16,17 o cadena de ADN desplazamiento 18 tecnologías. Los recientes desarrollos en protocolos de selección de aptámeros 19-21 permiten el diseño de nanorobots respondera una gama cada vez mayor de las moléculas y los tipos de células.
Un trabajo anterior mostró una nanorobot que lleva un anticuerpo específico, que tras la unión a su antígeno puede transmitir o bien un inhibidor o una señal prolífico en el interior de tipos específicos de células en una población de células mixtas 15. Una característica interesante de estos nanodispositivos es su capacidad para realizar aún más tareas complejas y el control de la lógica con la introducción de diferentes subtipos nanorobot en una sola población. Recientemente hemos demostrado subtipos específicos de nanorobots que realizan, ya sea como reguladores positivos o negativos, controlando una población efectora que contiene una molécula de carga activa 22.
El protocolo que se presenta aquí describe la fabricación, purificación y obtención de imágenes de un nanorobot cerrada con secuencias de sensores aptámero que se unen selectivamente a PDGF para facilitar la apertura de la nanorobot 15,22. El proceso de fabricación descrito es similar a la nproceso de fabricación anorobot representado inicialmente por Douglas et al. 15 con los cambios destinados a reducir la duración total del proceso, al tiempo que aumenta las tasas de rendimiento y purificación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito la fabricación, la purificación, y la visualización del nanorobot ADN. Después de la fabricación del chasis hexagonal del dispositivo, la función de la nanorobot está programado con la simple introducción de la carga específica y hebras de detección para el robot que encontrar fácilmente su posición designada debido a la complementariedad de enlaces de hidrógeno con los sitios de conexión disponibles sola hebra 14 , 15,22.
El protocolo de fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a S. Douglas para las discusiones y consejos muy valiosos, y todos los miembros del laboratorio Bachelet útil para los debates y el trabajo. Este trabajo es apoyado por becas de la Facultad de Ciencias de la Vida y el Instituto de Nanotecnología y Materiales Avanzados de la Universidad de Bar-Ilan.
Materials
| DNase/RNase free distilled water | Gibco | 10977 |
| M13mp18 ssDNA scaffold | NEB | N4040S |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO | Amicon | UFC510024 |
| Agarose | Promega | V3125 |
| TBE buffer | Promega | V4251 |
| Ethidium bromide 10mg/ml solution | Sigma Aldrich | E1510 |
| 1 kb DNA marker | NEB | N3232S |
| Loading Dye | NEB | B7021S |
| uranyl formate | polysciences | 24762 |
| carbon-coated TEM grids | Science services | EFCF400-Cu-50 |
| Thermal Cycler c1000 Touch | Bio-Rad | |
| Glow Discharge K100X | Emitech | |
| UV table Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | |
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
References
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