DNA 접기에서 바이오 응답 로봇의 폴딩 및 특성화
Summary
DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).
Abstract
DNA의 나노 로봇은 내부 압수 특정 자극과 현재화물에 대한 응답으로 열 수 있도록 설계 중공 육각형 나노 장치이다. 모두 자극 및화물 특정 필요에 따라 맞출 수 있습니다. 여기에서 우리는 DNA 종이 접기 기술을 이용하여, DNA의 나노 로봇 제조 프로토콜을 설명합니다. 절차는 폴딩 완충액의 존재하에 긴 원형의 단일 가닥 DNA 골격에 첨가 스톡 혼합물에 짧은 단일 가닥 DNA 스테이플을 혼합함으로써 개시한다. 표준 열 사이 클러 서서히 나노 로봇의 폴딩 뒤에 안내 힘 스테이플 간 지지체 소둔을 용이하게하기 위해 혼합 반응 온도를 낮추기 위해 프로그래밍된다. 60 시간 폴딩 반응이 완료되면, 과량의 스테이플은 아가 로스 겔 전기 영동 (AGE)을 통해 가시화 하였다 원심 필터를 이용하여 폐기된다. 마지막으로, 나노 로봇의 성공적인 제조는 (TEM) 투과 전자 현미경에 의해 확인되고,부정적인 얼룩 등의 우라 닐 – 메이트의 사용과.
Introduction
핵산 나노 기술의 사용은 놀라운 있습니다. 왓슨 – 크릭 염기 쌍의 취급 용이성뿐만 아니라 주문품 올리고 2의 대규모 합성의 용이성 및 상대적 저비용 DNA 나노 기술의 분야에서 응용 프로그램 (3)의 폭발 및 연구를 생성했다. 기본적인 빌딩 블록으로 움직이지 시먼 접합 4,5에 기반 구조의 DNA 나노 기술은 임의의 모양 6-8의 건설을위한 자기 조립 초 단위로 DNA를 사용합니다.
스캐 폴딩 DNA 종이 접기 (9) 기술의 최근 개발은 나노 미터 이하의 정밀도와 복잡한 2D / 3D 나노 구조 10-12의 건설을 허용하고 증가하는 복잡성과 놀라운 다양성과 새로운 기능 객체를 구축하기위한 효율적인 경로입니다. 건조 공정이 긴 골격 단일 가닥 DNA에 기초하고, 일반적으로 바이러스로부터 유래 genom짧은 단일 가닥 DNA를 올리고 수백의 교잡을 통해 접을 수있는 전자는 스테이플 불린다. 제조의 재현성을 달성 할 수있는 최대의 수소 결합 상보성을 용이하게하기 위해 짧은 단일 가닥 스테이플 서열 원단의 결과 동안이 기술에 의해 얻어진 높은 구조적 해상도, DNA 이중 나선의 천연 치수의 직접적인 결과이다. 느린 어닐링 온도를 사용하여 열역학적으로 바람직한 나노 구조물을 고 수율 및 정확도에 도달 할 때 설계는 낮은 에너지를, 램프. 컴퓨터 코드의 접합부 설계 규칙의 구현은 매우 쉽게 연결 접합부 수백 함유 크고 복잡한 구조물을 설계하는 등의 작업을 단순화 caDNAno 13 CAD 도구의 개발을 활성화.
우리는 이전에 caDNAno 공구 14,15의 도움으로 DNA의 나노 로봇의 디자인을 설명했다. 여기에 우리가 제작을 묘사하고투과 전자 현미경 (TEM)을 통해 시각화의 차원 나노 로봇, 3 차원 중공 육방 나노 소자의 소정의 자극과 본 구체적인화물에 응답 주요 형태 변화를 겪게하도록 설계된 35 X 35 X 50 내지 3, 이러한 단백질 또는 핵산으로 올리고, 안쪽 압수. 로딩 스테이션 (12)은 중공 내부 섀시 사용할 수 있지만, 바인딩화물의 실제 수는화물의 크기와 다르다. 화물 분자는 작은 DNA 분자에서 효소, 항체 및 5 ~ 10 nm의 금 나노 입자에 이르기까지 다양합니다. 각각의 나노 로봇은 다른 분자의 혼합물을 함유하도록, 균일 또는 불균일 될 Cargocan 하나. 감지는 aptasensor 16, 17 또는 DNA 가닥 변위 (18) 기술 중 하나, 단백질, 핵산 또는 다른 화학 물질을 감지하는 두 개의 더블 헬리컬 잠금 게이트 디자인을 통해 달성을 기반으로합니다. 앱 타머 선택 프로토콜 19-21에서 최근의 발전 응답 나노 로봇의 디자인을 사용분자 및 세포 유형의 범위도 증가한다.
초기 연구는 항원에 결합하는 억제 성 또는 혼합 된 세포 집단 (15)의 특정 세포 유형의 내부에 다작 신호를 릴레이 할 때 특이 적 항체를 운반 나노 로봇을 보였다. 이러한 나노의 흥미로운 기능은 하나의 집단에서 서로 다른 나노 로봇 하위 유형의 도입으로 더욱 복잡한 작업 및 로직 제어를 수행 할 수있는 능력이다. 최근에 우리는 활성화물 분자 (22)를 포함하는 이펙터 인구를 제어, 양 또는 음의 규제 중 하나로 수행하는 나노 로봇의 특정 아형을 보여 주었다.
여기에 제시된 프로토콜은 나노 로봇 15, 22의 개방을 용이하게하기 위해 선택적으로 결합 PDGF 앱 타머 센서 서열 게이팅 나노 로봇의 제조, 정제 및 이미지를 설명한다. 설명 된 제조 공정과 유사한 N정제 수율 및 속도를 증가시키면서 anorobot 제작 공정은 먼저, 더글라스 외. 전체 공정 시간을 줄이기위한 변화 (15)에 의해 도시.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 DNA의 나노 로봇의 제조, 정제 및 시각화를 설명했다. 장치의 육방 섀시의 제작 후, 나노 로봇의 기능을 용이하게 때문에 가능한 단일 가닥 도킹 위치 (14)와 수소 결합 상보성에 그 지정 위치를 찾을 로봇 특정화물의 간단한 소개와 감지 가닥 프로그래밍 , 15, 22.
기재된 제조 프로토콜은 일반적으로 접기 광범위한 형상 폴드 연구실에서 사용되는 느린 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 매우 가치있는 토론과 조언, 도움이 토론과 작업 바첼 레트 연구소의 모든 구성원에 대한 S. 더글러스을 감사드립니다. 이 작품은 바 – 일란 대학의 생명 과학 학부 및 나노 기술 및 신소재 연구소에서 보조금에 의해 지원됩니다.
Materials
| DNase/RNase free distilled water | Gibco | 10977 |
| M13mp18 ssDNA scaffold | NEB | N4040S |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO | Amicon | UFC510024 |
| Agarose | Promega | V3125 |
| TBE buffer | Promega | V4251 |
| Ethidium bromide 10mg/ml solution | Sigma Aldrich | E1510 |
| 1 kb DNA marker | NEB | N3232S |
| Loading Dye | NEB | B7021S |
| uranyl formate | polysciences | 24762 |
| carbon-coated TEM grids | Science services | EFCF400-Cu-50 |
| Thermal Cycler c1000 Touch | Bio-Rad | |
| Glow Discharge K100X | Emitech | |
| UV table Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | |
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
References
- Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
- Kosuri, S., Church, G. M. Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications. Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).
- Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology. Nature Nanotech. 6 (12), 763-772 (2011).
- Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J Theor Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
- Chen, J. H., Seeman, N. C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature. 350 (6319), 631-633 (1991).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Yin, P., Hariadi, R. F., Sahu, S., Choi, H. M. T., Park, S. H., Labean, T. H., Reif, J. H. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Zhang, F., Nangreave, J., Liu, Y., Yan, H. Structural DNA nanotechnology: state of the art and future perspective. J Am Chem Soc. 136 (32), 11198-11211 (2014).
- Douglas, S. M., et al. Prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. J Vis Exp. (77), e50268 (2013).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Tan, W., Donovan, M. J., Jiang, J. Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications. Chem Rev. 113 (4), 2842-2862 (2013).
- Xiang, D., et al. Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: The Next Generation of Cancer Medicine. Theranostics. 5 (1), 23-42 (2015).
- Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nat Chem. 3 (2), 103-113 (2011).
- Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells. Clin Chem. 55 (4), 813-822 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Prot. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and Opportunities for Small Molecule Aptamer Development. J Nucleic Acids. 2012, (2012).
- Amir, Y., et al. Universal computing by DNA origami robots in a living animal. Nature Nanotech. 9 (5), 353-357 (2014).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Meth. 8 (3), 221-229 (2011).
- Sobczak, J. P., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid folding of DNA into nanoscale shapes at constant temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).
- Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).
