Summary

К Biomimicking Вуд: сварная свободно стоящие фильмы Nanocellulose, лигнин, и синтетический поликатиона

Published: June 17, 2014
doi:

Summary

Целью данного исследования было формирование синтетического клеточной стенки растений ткани с помощью слой за слоем сборку nanocellulose волокон и изолированный лигнин, собранный из разбавленных водных суспензий. Методы измерения поверхности кристалла кварца и микроскопии атомно-силовых использовались для наблюдения за формирование нанокомпозита полимерного материала-полимера.

Abstract

Древесные материалы состоят из клеточных стенок растений, которые содержат слоистую вторичной клеточной стенки, состоящей из структурных полимеров полисахаридов и лигнина. Слой за слоем (LBL) в сборе процесс, который зависит от сборки противоположно заряженных молекул из водных растворов был использован для создания автономных композитной пленки изолированных древесины полимеров лигнина и окисленного nanofibril целлюлозы (NFC). Чтобы облегчить сборку этих отрицательно заряженных полимеров, положительно заряженный полиэлектролит, поли (хлорид diallyldimethylammomium) (PDDA), был использован в качестве связующей слоя для создания этой упрощенной модели клеточной стенки. Слоистая процесс адсорбции изучали количественно с помощью кристалла кварца с контролем диссипации (QCM-D) и эллипсометрии. Результаты показали, что масса слоя / толщина в адсорбционном слое увеличен в зависимости от общего количества слоев. Поверхность покрытия из адсорбированных слоев изучали с атомно-силовой микроскопии (АСМ).Полный охват поверхности с лигнином во всех циклов осаждения был найден в системе, однако, покрытие поверхности по NFC увеличивается с числом слоев. Процесс адсорбции проводили в течение 250 циклов (500 бислоев) на ацетата целлюлозы (СА) подложки. Были получены прозрачные свободно стоящие LBL собраны нанокомпозитных пленок, когда Калифорния субстрат позже растворяют в ацетоне. Сканирующей электронной микроскопии (SEM) из разрушенных сечений показали слоистую структуру, а толщина в адсорбционном цикле (PDDA-Лигнин-PDDA-NC), по оценкам, 17 нм для двух различных типов лигнина, используемых в исследовании. Данные показывают, пленку с тщательно контролируемой архитектуры, где nanocellulose и лигнин пространственно нанесенного на наноуровне (а полимер-полимерных нанокомпозитов), аналогично тому, что наблюдается в нативной клеточной стенки.

Introduction

Существует большой интерес для получения дополнительных химических веществ и топлива из биомассы, как углерод, поглощенный растениями в процессе фотосинтеза является частью текущей СО 2 цикла. Большинство поглощенного углерода (42-44%) в виде целлюлозы, полимер, состоящий из β 1-4-связанных единиц глюкопиранозы; когда гидролизован, глюкоза может быть использован в качестве основного реагента для ферментации в спирт топлива. Однако клеточной стенки архитектура древесных растений развивалась тысячелетиями, создающих материал, который устойчив к деградации природной среды 1. Эта стабильность переносится в промышленной переработке древесных материалов, таких как энергетических культур делает целлюлозу трудно получить доступ, изолировать, и пробой в глюкозу. Более пристальный взгляд на ультраструктуры вторичном клеточной стенки показывает, что она представляет собой полимер, нанокомпозит состоит из слоистых микрофибриллами паракристаллический целлюлозы, встроенных в аморфной матрице лигнина и подолуicelluloses 2-4. Продольно ориентированные микрофибрилл целлюлозы имеют диаметр приблизительно 2-5 нм, что агрегируются вместе с другими гетероатомов полисахаридов с образованием более крупных единиц фибрилл пучков 5. Фибрилл пучки встроен в лигнин-гемицеллюлозы комплекс, состоящий из аморфного полимера фенилпропанола единиц с некоторыми связи с другими гетероатомов, таких как полисахариды glucoronoxylan 4. Кроме того, эта структура далее организованы в слоях или пластин, на протяжении одревесневшего вторичной клеточной стенки 6-8. Ферменты, как целлюлазы, имеют очень трудное время с доступом целлюлозу в клеточной стенке, как это находится в его фибрилл форме и заливали в лигнина. Суть действительно делает биологического происхождения топлива и возобновляемые источники химического платформы на реальность заключается в разработке процессов, которые экономически позволяющие осахаривания целлюлозы в своей нативной форме.

Новые химические и визуализации технологии пособничество в стUdy из механизмов, участвующих в осахаривания 9,10 целлюлозы. Большая работа была направлена ​​на комбинационного конфокальной микроскопии 11 и атомно-силовой микроскопии 12 для изучения химического состава и морфологии клеточной стенки. Будучи в состоянии внимательно следить механизмы делигнификации и осахаривания является значительным шагом вперед, влияющих на преобразование целлюлозы в глюкозу. Осахаривание модельных поверхностей целлюлозы была проанализирована путем измерения ферментативной кинетики ставки с кристалла кварца с контролем диссипации (QCM-D) 13. Тем не менее, родные стены клеток, являются очень сложными, как указано выше, и это создает двусмысленность, как различные процессы преобразования изменить структуру клеточной стенки растений (молекулярной массы полимера, химических связей, пористости). Отдельно стоящие модели клеточной стенки веществ с известной структурного состава будет решить эту проблему и позволяют интегрировать образцов в состоянии дел искусства химических и томографовнг оборудование.

Существует нехватка моделей клеточной стенки и мало доступны могут быть классифицированы как смесей полимерных материалов и регенерируется целлюлозу или бактериальной целлюлозы 14, ферментативно полимеризованные лигнина-полисахарид композитов 15-17 или модели поверхности 18-21. Некоторые модели, которые начинают походить на клеточную стенку являются образцы, содержащие лигнин предшественники или аналогов полимеризованные ферментативно в присутствии целлюлозы в его микрофибриллярного форме. Однако эти материалы страдают от отсутствия организованной архитектуры слоя. Простой маршрут для создания нанокомпозитных материалов с организованной архитектуры является слой за слоем (LBL) метод сборки, на основе последовательного адсорбции полимеров или наночастиц с дополнительными сборов или функциональных групп с образованием организованных многослойных композиционных пленок 22-25. Отдельно стоящие гибридные нанокомпозиты из высокой прочностью, сделанные LBL осаждения полимера и паnoparticles, были сообщены Котов и др.. 26-30. Среди многих других приложений, LBL фильмы были также исследованы на предмет их потенциального использования в терапевтических доставки 31 клеточных мембран топливных 32,33, батарей 34 и лигноцеллюлозной поверхности волокна модификации 35-37. Последнее время интерес к наноразмерных целлюлозы на основе композиционных материалов привели к подготовке и характеристике LBL многослойных целлюлозных нанокристаллов (ЧПУ), подготовленных гидролиза серной кислоты целлюлозных волокон, и положительно заряженных полиэлектролитов 38-43. Подобные исследования также были проведены с нанокристаллов целлюлозы, полученных из морских tunicin и катионных полиэлектролитов 44, с ЧПУ и ксилоглюкан 45 и ЧПУ и хитозана 46. Lbl многослойный формирование карбоксилированный nanofibrillated целлюлозы (НКЦ), полученных высокого давления гомогенизации целлюлозных волокон с катионных полиэлектролитов также былучился 47-49. Препарат, свойства и применение систем ЧПУ и nanofibrillated целлюлозы были подробно рассмотрены 50-53.

Настоящее исследование предполагает изучение LBL техники в качестве потенциального пути, чтобы собрать разрозненные лигноцеллюлозных полимеры (например, nanocellulose и лигнина) в упорядоченном моды в качестве первого шага на пути к биомиметического лигноцеллюлозной композита с пластинчатой ​​структурой. Методика Lbl был выбран за его доброкачественных условий обработки, таких как, температуры окружающей среды, давления и воды в качестве растворителя, которые условия для естественного композита 54. В этом исследовании мы сообщаем о многослойной наращиванием материальных компонентов древесины, а именно целлюлозы микрофибриллами от тетраметилпиперидина 1-оксил (ТЭМП), перекисного окисления липидов целлюлозы и изолированной лигнина в свободно стоящих пластинчатых фильмов. Два различных лигнинов используются с различными методами экстракции, один технический лигнин из Organosolv варки, а другой лигнин, выделенный из шарового размола с меньшим изменением в процессе выделения. Эти соединения в сочетании с синтетическим полиэлектролита в этой первоначального исследования, чтобы продемонстрировать возможности создания стабильных свободно стоящие фильмы с архитектурой, аналогичной родной клеточной стенки.

Protocol

1. Nanofibrillated Целлюлоза Подготовка 55 Настройка 3 л трехгорлая колба 2 л деионизированной воды, подвесной мешалкой, и рН зонда. Добавить делигнификации крафт-целлюлозы, 88% яркости (20 г, 1% (вес / объем, сухой массе)), 2,2,6,6-тетраметилпиперидин 1-оксил (TEMPO) (0,313 г, 0,1 ммоль / г целлюлоз?…

Representative Results

QCM-D Анализ структурированных Изготовление Вуди полимерной пленки LBL адсорбции лигнина, NFC и PDDA контролировали в реальном времени с QCM-D в двух различных экспериментах с участием двух типов лигнинов. Этот метод анализа очень чувствительны, чтобы обнаружить изменения в част?…

Discussion

Изготовление Nanocellulose

Для изготовления nanocellulose успешное окисление волокна целлюлозы необходимо для легкому аритмией. Окисление управляется доступного гипохлорита натрия, который должен быть добавлен медленно в известных количествах в зависимости от количества целлюло?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана, прежде всего, программы докторской ученого Института критической технологии и прикладных наук (ICTAS) в Технологическом университете Вирджинии, в Virginia Tech Высшей школы за поддержку устойчивого программу по нанотехнологиям, а также Соединенные Штаты Департамента сельского хозяйства, НИФА номер гранта 2010-65504-20429. Авторы также благодарят вклад Рик Caudill, Стивен Маккартни и В. Трэвис Церкви в этой работе.

Materials

sulfate pulp Weyerhaeuser  donated brightness level of 88%
organosolv lignin Sigma Aldrich 371017 discontinued
hardwood milled wood lignin see reference in paper
polydiallyldimethylammonium chloride  Sigma Aldrich 409022 Mn = 7.2×10^4, Mw=2.4×10^5
2,2,6,6-Tetramethylpiperidine 1-oxyl (TEMPO)  Sigma Aldrich 214000 catalytic oxidation of primary alcohols to aldehydes with a purity of 98%, molecular weight is 156.25g/mol
sodium bromide Sigma Aldrich S4547 purity ≥99.0%, molecular weight 102.89
sodium hypochlorite Sigma Aldrich 425044 reagent grade, available chlorine 10~15%, molecular weight 74.44g/mol
sodium hydroxide VWR BDH7221-4 0.5N aqueous solution, density 1.02g/ml, molecular weight 40 g/mol
sodium hydroxide Acros Organics AC12419-0010 0.1N aquesous solution, specific gravity 1.0 g/ml, molecular weight 40 g/mol
ammonium hydroxide Acros Organics AC39003-0025 25% solution in water, pH 13.6, density 0.89, molecular weight 35.04 g/mol
hydrogen peroxide Fisher Scientific H325-100 30.0~32.0% certified ACS, pH 3.3, density 1.11
Mica sheets TED Pella NC9655733 Pelco, grade V5, 10×40mm, 23mm T, minimum air and bubbles, very clean
sulfuric acid Fisher Scientific A300-212 95.0~98.0 w/w%, certified ACS plus, molecular weight 98.08 g/mol
cellulose acetate McMaster Carr 8564K44 degree of substitution 2.5
ethanol Decon Laboratories 04-355-223 200 proof (100%), USP
acetone Fisher Scientific A18-4 purity ≥99.5%, certified ACS reagent grade, density 0.79 g/ml, molecular weight 58.08 g/mol
syringy pump Harvard Apparatus 552226 pump 22 infusion/withdraw with standard syringe holder, flow rate 0.002 ul/h~55.1ml/min
Mill-Q water purification system EMD Millipore D3-UV Direct-Q, UV, water conductivity 18.5 MΩ cm with 20 liter reservair
pH meter Mettler Toledo SeverMulti
balance Mettler Toledo AB135-S accuracy 0.1mg
atomic force microscope Asylum Research MFP-3D, Olympic fluorescent microscope stage
ellipsometer Beaglehole Instruments
fiber centrifuge unknown basket style centrifuge
Warring blender Warring Commercial
ultrasonic processor Sonics Sonics 750W, sound enclosure
Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) Q-Sense Inc.  E4 measure fundamental frequency of 5MHz, and monitor odd number overtones/harmonics from 3~13, use gold-coated piezoelectric quartz crystals
automatted dipper arm Lynxmotion

References

  1. Fratzl, P., et al. On the role of interface polymers for the mechanics of natural polymeric composites. Phys. Chem. Chem. Phys. 6, 5575-5579 (2004).
  2. Terashima, N., Fukushima, K., He, L. F., Takabe, K. Forage cell wall structure and digestibity. American Society of Agronomy. , 247-270 (1993).
  3. Himmel, M. E., et al. Biomass Recalcitrance: Engineering Plants and Enzymes for Biofuels Production. Science. 315, 804-807 (2007).
  4. Terashima, N., et al. Nanostructural assembly of cellulose, hemicellulose, and lignin in the middle layer of secondary wall of ginkgo tracheid. J. Wood. Sci. 55, 409-416 (2009).
  5. Fahlén, J., Salmén, L. Pore and Matrix Distribution in the Fiber Wall Revealed by Atomic Force Microscopy and Image Analysis. Biomacromolecules. 6, 433-438 (2005).
  6. Baer, E., et al. Biological and synthetic hierarchical composites. Phys. Today. 45, 60-67 (1992).
  7. Tirrell, D. A., Aksay, I., Baer, E., Calvert, P. D., Cappello, J., Dimarzio, E. A., Evans, E. A., Fessler, J. Hierarchical structures in biology as a guide for new materials technology. National Academy of Sciences. , (1994).
  8. Fengel, D., Wegener, G. . Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions. , (1984).
  9. Santa-Maria, M., Jeoh, T. Molecular-Scale Investigations of Cellulose Microstructure during Enzymatic Hydrolysis. Biomacromolecules. 11, 2000-2007 (2010).
  10. Saar, B. G., et al. Label-free, real-time monitoring of biomass processing with stimulated Raman scattering microscopy. Angew. Chem. Int. Edit. 49, 5476-5479 (2010).
  11. Schmidt, M., et al. Label-free in situ imaging of lignification in the cell wall of low lignin transgenic Populus trichocarpa. Planta. 230, 589-597 (2009).
  12. Ding, S. -. Y., Himmel, M. E. The maize primary cell wall microfibril: a new model derived from direct visualization. J. Agricul. Food Chem. 54, 597-606 (2006).
  13. Turon, X., et al. Enzymatic kinetics of cellulose hydrolysis: a QCM-D study. Langmuir. 24, 3880-3887 (2008).
  14. Dammströem, S., et al. On the interactions between cellulose and xylan, a biomimetic simulation of the hardwood cell wall. BioResources. 4, 3-14 (2009).
  15. Barakat, A., et al. Studies of xylan interactions and cross-linking to synthetic lignins formed by bulk and end-wise polymerization: a model study of lignin carbohydrate complex formation. Planta. 226, 267-281 (2007).
  16. Micic, M., et al. Study of the lignin model compound supramolecular structure by combination of near-field scanning optical microscopy and atomic force microscopy. Colloids Surf. B Biointerfaces. 34, 33-40 (2004).
  17. Li, Z., et al. Nanocomposites prepared by in situ enzymatic polymerization of phenol with TEMPO-oxidized nanocellulose. Cellulose. 17, 57-68 (2010).
  18. Gradwell, S. E., et al. Surface modification of cellulose fibers: towards wood composites by biomimetics. C. R. Biologies. 327, 945-953 (2004).
  19. Kaya, A., et al. Surface plasmon resonance studies of pullulan and pullulan cinnamate adsorption onto cellulose. Biomacromolecules. 10, 2451-2459 (2009).
  20. Gustafsson, E., et al. Direct adhesive measurements between wood biopolymer model surfaces. Biomacromolecules. 13, 3046-3053 (2012).
  21. Karabulut, E., Wagberg, L. Design and characterization of cellulose nanofibril-based freestanding films prepared by layer-by-layer deposition technique. Soft Matter. 7, 3467-3474 (2011).
  22. Decher, G., Hong, J. D. Buildup of ultrathin multilayer films by a self-assembly process: II. consecutive adsorption of anionic and cationic bipolar amphiphiles and polyelectrolytes on charged surfaces. Ber. Bunsen. Phys. Chem. 95, 1430-1434 (1991).
  23. Decher, G. Fuzzy nanoassemblies: toward layered polymeric multicomposites. Science. 277, 1232 (1997).
  24. Hammond, P. T. Form and function in multilayer assembly: new applications at the nanoscale. Adv. Mater. 16, 1271-1293 (2004).
  25. Decher, G., Schlenoff, J. B. . Multilayer thin films- sequential assembly of nanocomposite materials. , (2003).
  26. Mamedov, A. A., Kotov, N. A. Free-standing layer-by-layer assembled films of magnetite nanoparticles. Langmuir. 16, 5530-5533 (2000).
  27. Mamedov, A. A., et al. Molecular design of strong single-wall carbon nanotube/polyelectrolyte multilayer composites. Nat. Mater. 1, 257-257 (2002).
  28. Podsiadlo, P., et al. Fusion of seashell nacre and marine bioadhesive analogs: high-strength nanocomposite by layer-by-layer assembly of clay and L-3,4-dihydroxyphenylalanine polymer. Adv. Mater. 19, 949-955 (2007).
  29. Podsiadlo, P., et al. Ultrastrong and stiff layered polymer nanocomposites. Science. 318, 80-83 (2007).
  30. Podsiadlo, P., et al. Can nature’s design be improved upon? High strength, transparent nacre-like nanocomposites with double network of sacrificial cross links. J. Phys. Chem. B. 112, 14359-14363 (2008).
  31. Becker, A. L., et al. Layer-by-layer-assembled capsules and films for therapeutic delivery. Small. 6 (17), (2010).
  32. Taylor, A. D., et al. Fuel cell membrane electrode assemblies fabricated by layer-by-layer electrostatic self-assembly techniques. Adv. Funct. Mater. 18, 3003-3009 (2008).
  33. Ashcraft, J. N., et al. Structure-property studies of highly conductive layer-by-layer assembled membranes for fuel cell PEM applications. J. Mater. Chem. 20, 6250-6257 (2010).
  34. Lee, S. W., et al. High-power lithium batteries from functionalized carbon-nanotube electrodes. Nat. Nano. 5, 531-537 (2010).
  35. Eriksson, M., et al. The influence on paper strength properties when building multilayers of weak polyelectrolytes onto wood fibres. J. Colloid Interf. Sci. 292, 38-45 (2005).
  36. Lvov, Y. M., et al. Dry and wet strength of paper: layer-by-layer nanocoating of mill broken fibers for improved paper. 21, 552-557 (2006).
  37. Lin, Z., et al. Nanocomposite-based lignocellulosic fibers 1. Thermal stability of modified fibers with clay-polyelectrolyte multilayers. Cellulose. 15, 333-346 (2008).
  38. Cranston, E. D., Gray, D. G., Barrett, C. J. Abstracts; 32nd Northeast Regional Meeting of the American Chemical Society. , (2004).
  39. Podsiadlo, P., et al. Molecularly engineered nanocomposites: layer-by-layer assembly of cellulose nanocrystals. Biomacromolecules. 6, 2914-2918 (2005).
  40. Cranston, E. D., Gray, D. G. Formation of cellulose-based electrostatic layer-by-layer films in a magnetic field. Sci. Tech. Adv. Mater. 7, 319-321 (2006).
  41. Cranston, E. D., Gray, D. G. Morphological and optical characterization of polyelectrolyte multilayers incorporating nanocrystalline cellulose. Biomacromolecules. 7, 2522-2530 (2006).
  42. Jean, B., et al. Structural details of cellulose nanocrystals/polyelectrolytes multilayers probed by neutron reflectivity and AFM. Langmuir. 24, 3452-3458 (2008).
  43. Renneckar, S., Zink-Sharp, A., Esker Alan, R., Johnson Richard, K., Glasser Wolfgang, G. Cellulose Nanocomposites. ACS Symposium Series. , 78-96 (2006).
  44. Podsiadlo, P., et al. Layer-by-layer assembled films of cellulose nanowires with antireflective properties. Langmuir. 23, 7901-7906 (2007).
  45. Jean, B., et al. Non-electrostatic building of biomimetic cellulose-xyloglucan multilayers. Langmuir. 25, 3920-3923 (2009).
  46. de Mesquita, J. P., et al. Biobased nanocomposites from layer-by-layer assembly of cellulose nanowhiskers with chitosan. Biomacromolecules. 11, 473-480 (2010).
  47. Wågberg, L., et al. The build-up of polyelectrolyte multilayers of microfibrillated cellulose and cationic polyelectrolytes. Langmuir. 24, 784-795 (2008).
  48. Aulin, C., et al. Buildup of polyelectrolyte multilayers of polyethyleneimine and microfibrillated cellulose studied by in situ dual-polarization interferometry and quartz crystal microbalance with dissipation. Langmuir. 24, 2509-2518 (2008).
  49. Aulin, C., et al. Self-organized films from cellulose I nanofibrils using the layer-by-layer technique. Biomacromolecules. 11, 872-882 (2010).
  50. Azizi Samir, M. A., et al. Review of recent research into cellulosic whiskers, their properties and their application in nanocomposite field. Biomacromolecules. 6, 612-626 (2005).
  51. Siró, I., Plackett, D. Microfibrillated cellulose and new nanocomposite materials: a review. Cellulose. 17, 459-494 (2010).
  52. Eichhorn, S., et al. Review: current international research into cellulose nanofibres and nanocomposites. J. Mat. Sci. 45, 1-33 (2010).
  53. Habibi, Y., et al. Cellulose nanocrystals: chemistry, self-assembly, and applications. Chem. Rev. 110, 3479 (2010).
  54. Teeri, T. T., et al. Biomimetic engineering of cellulose-based materials. Trends Biotechnol. 25, 299-306 (2007).
  55. Saito, T., et al. Homogeneous suspensions of individualized microfibrils from TEMPO-catalyzed oxidation of native cellulose. Biomacromolecules. 7, 1687-1691 (2006).
  56. Pillai, K. V., Renneckar, S. Cation-π Interactions as a Mechanism in Technical Lignin Adsorption to Cationic Surfaces. Biomacromolecules. 10, 798-804 (2009).
  57. Notley, S. M., Norgren, M. Adsorption of a strong polyelectrolyte to model lignin surfaces. Biomacromolecules. 9, 2081-2086 (2008).
  58. Aulin, C., et al. Buildup of polyelectrolyte multilayers of polyethyleneimine and microfibrillated cellulose studied by in situ dual-polarization interferometry and quartz crystal microbalance with dissipation. Langmuir. 24, 2509-2518 (2008).
  59. Argun, A. A., et al. Highly conductive, methanol resistant polyelectrolyte multilayers. Adv. Mater. 20, 1539-1543 (2008).
  60. Li, Q., Renneckar, S. Molecularly thin nanoparticles from cellulose: isolation of sub-microfibrillar structures. Cellulose. 16, 1025-1032 (2009).
  61. Höök, F., et al. Variations in coupled water, viscoelastic properties, and film thickness of a Mefp-1 protein film during adsorption and cross-linking: a auartz crystal microbalance with dissipation monitoring, ellipsometry, and surface plasmon resonance study. Anal. Chem. 73, 5796-5804 (2001).
  62. Naderi, A., Claesson, P. M. Adsorption properties of polyelectrolyte-surfactant complexes on hydrophobic surfaces studied by QCM-D. Langmuir. 22, 7639-7645 (2006).
  63. Kaufman, E. D., et al. Probing protein adsorption onto mercaptoundecanoic acid stabilized gold nanoparticles and surfaces by quartz crystal microbalance and z-potential measurements. Langmuir. 23, 6053-6062 (2007).
  64. Glasser, W. G., Barnett, C. A., Sano, Y. Classification of lignins with different genetic and industrial origins. J. Appl. Polym. Sci.: Appl. Polym. Symp. , (1983).
  65. Van de Steeg, H. G. M., et al. Polyelectrolyte adsorption: a subtle balance of forces. Langmuir. 8, 2538-2546 (1992).

Play Video

Cite This Article
Pillai, K., Navarro Arzate, F., Zhang, W., Renneckar, S. Towards Biomimicking Wood: Fabricated Free-standing Films of Nanocellulose, Lignin, and a Synthetic Polycation. J. Vis. Exp. (88), e51257, doi:10.3791/51257 (2014).

View Video