における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル<em> C.虫</em

1。C.虫の成長 35ミリメートル線虫増殖培地（NGM）を準備し、寒天プレートは、標準的な栽培方法1に従って、OP50細菌を播種。 シードされたNGMプレートに6妊娠成人を配置することにより、 線虫を同期します。 〜100卵（〜3時間）敷設された後に成人を削除します。 ワームは若年成人期に開発され、この実験のために最適であることになる、その時点で20℃で3日間培養する。 Cを同期するための代替プロトコル虫は、他の場所で10記述されている。 2。 ASのための材料 M9緩衝液（22mMのKH 2 PO 4、42mMののNa 2 HPO 4、86 mMのNaCl、1mMのMgSO 4）し、実験前に30分間（アルゴンを使用することもできる）N 2で平衡化することによって酸素をパージされたいと氷に囲まれ続けた。 小さな穴（3ミリメートルを作る）幅を1.5 mlマイクロチューブのふたにするワームは、AS間に配置されます。これは、過剰なメディアの蒸発につながることができように穴が開いた蓋を維持することなく、ガス交換を可能にします。 3。無酸素症/飢餓少なくとも三連ですべての実験を行っています。 上記のように成長し、若い成虫を含む各35ミリメートルプレートに、RTの1ミリリットル、酸素化のM9バッファーを追加します。 （細菌が播種されていないエッジにM9を追加）をプレートから細菌を削除しないように注意してください。 〜1分後、ワームはM9で泳ぐ必要があります。 ピペット及び滅菌の1％BSA溶液を排出することによりコートBSAで1mlのピペットチップ。 慎重にM9バッファ内のワームを含むプレートを傾け、それを添加した同じ場所からM9を削除し、準備されたマイクロ遠心チューブにサスペンションを配置。ワームは、チューブの底に落ちているまで氷で休息をしましょう​​（〜1-2分）。 （約100μLを残す）チューブからワームを乱すことなく可能なM9の最大量を削除し、酸素をパージし、アイスM9の1ミリリットルを追加し、ワームが再び底に沈殿するまで、氷の上のチューブを配置します。最後のステップ3回繰り返します。 〜100μlをチューブ内に残るまで最後の洗浄では、M9を削除します。 （3.6.2項は、以下の手順を参照してください）​​カスタム密閉された容器に、あるいは、（以下の手順は、セクション3.6.1を参照）、または無酸素/低酸素チャンバー内の脱酸素M9でのワームとチューブを配置します。 商業無酸素/低酸素室を使用する場合は、ステップ3.5を起動する前に室内にいくつかのパージM9を残して、ワームが室内にあると、ステップ3.5を繰り返します。 カスタム·チャンバを使用する場合は、低コストの装置を作成する方法の詳細な説明は、このプロトコルの終わりに提示され、以前に11別のグループによって記載されている。簡単に言うと： <ol> 250ミリリットルタッパーウェア型容器の蓋に二つの穴を作り、それらにチューブコネクタを追加します。一方が他方の水浴内へのガス出口であって、一方のガス混合物を注入するために使用される。 チャンバー内にワームを置き、蓋を使用してチャンバーを密閉する。 一定のN 2フラックス（100ml /分）を有するガス。 26℃の水浴の中に容器を置き漏れが（チャンバ自体から発生する気泡によって見かけ上の）システム内に存在しないこと、および空気が返すように出口管が十分に水に浸されていることを確認します。 20時間26℃でワームをインキュベートする。 4。シミュレートされた再灌流 AS条件下での20時間後に、室内空気中にインキュベーションチャンバーからチューブを取り外します。 ピペットで OP50の上に（ステップ3.3のように）、BSAでコーティングされたチップを用いて虫が 35ミリメートルのNGMプレートを播種した。 24時間20℃で培養する。この後、ワームは採点されできるようになります。 5。ライブワームVERSUSデッドの識別プラチナのピックを使用して、軽くワームの頭の上をタッチします。ライブワームは触れられることの後に逆方向に移動します。ワームは応答しないであれば、死んだように得点。時折、ワームは後方に移動しませんが、わずかに左右に頭の動きを示すことができる。技術的には死んではいないが、これらのワームは、数時間以内に期限切れになることはほぼ確実であり、死んだとして採点されるべきである。 1ワームスコアが遅れる場合は、子孫の内部ハッチングが発生する可能性がありますし、これらの「バッグ·オブ·ワームは、「非常に困難な死体を検出すること、破裂することができます。 これらは重複してカウントを避けるためにカウントされるように、プレートの両方から生死ワームを削除します。ライブワームは行動アッセイを実行するために別のプレートに移動することができます。合計に対して生きているワームの量は、生き残ったワームの％として表されます（ 図1（A） </st栄>）。 6。応答アッセイをタッチこのプロトコルの詳細な説明は、ハート、アンC.編で提示されている。行動（2006年7月3日）、WormBook、エド。 C.虫研究コミュニティ、WormBook、doi/10.1895/wormbook.1.87.1、http://www.wormbook.org。 タッチレスポンスに得点を、移動して軽くまつげピック（ 図3）と（咽頭の中央部付近で）ワームの頭部の側面に触れているワームを識別します。 ワームは後方に移動した場合、などの応答性のスコア、そうでない場合、（ 図1B）などの非応答スコア。 10秒間隔でそれぞれのワームについて、このステップ10-15Xを繰り返します。正確なデータを有するように、各グループに少なくとも10ワームプローブ。同じアッセイは、前方、後方、体壁に軽いタッチを、次の運動器官の変化を評価するために使用することができる。これは明確な行動を刺激するので、ワームの頭や尾に触れないようにしてください。 最後に、中企業の遺伝子制御系統[負のポジティブ、MEC（機械刺激）変異体のためのN2ブリストル野生型- 例えば CB1338 MEC-3（e1338）IV]ワームに触れることをする力をキャリブレーションする。刺激の厳しすぎる少な野生N2コントロールで効果を引き出すませんが、MECの変異体における行動反応を誘発する。 7。神経細胞の変更神経細胞の修飾などのポストを視覚化するために、タッチ応答MECニューロン4,5にGFPを表現株を用いる。これらのニューロンは、体壁に沿って実行され、簡単に形態異常のために採点され、長いプロセスがある。また、形態学的情報は、上述したように、神経機能の行動尺度と統合することができる。この目的のために使用することができるOne株はC. TU2583から入手可能である虫遺伝学センターとあちこちGFPを発現uIs25組み込まれた導入遺伝子が含まれています統合MEC-3 :: GFP融合が含まれているMEC-18プロモーター、あるいはTU2562を、メートル。 アガロースパッドを準備します。 水にアガロース2％を溶かす10倍の在庫を1X M9にもたらす、そして70℃でのソリューションを維持その下側にテープの一枚を持ってそれぞれが2他のスライドの間に配置されたガラススライド（X 75ミリメートル25ミリメートル）で、この溶液の液滴（〜20μL）を配置します。 2％アガロース溶液の上に最初に垂直最終ガラススライドを置き、それが室温で冷ます。これは、テープの厚さのパッドを形成すべきである。 一番上のスライドを削除し、ワームを固定します0.1％テトラミゾールを含むM9の10μLを追加。 2％アガローススライド上にワームを生きて、いくつかの（〜10）を移動させる。それらの上にカバースリップを置き、適切な照明と100Xの対物レンズ下で蛍光顕微鏡を用いてGFPを可視化する。 損傷を受けたニューロンは、複数の涙（ 図2A）で構成プロセス、および/ ​​またはプロセス（ 図2B）が壊れているように見える異常における真珠パターンの細胞質ゾル膜文字列が表示されます。少なくとも10ワームの合計を使用して、各ワームのための両方の神経細胞における涙点や異常を数える。 8。ラボ製低酸素会議所タッパーウェアスタイル、密封可能な、密閉容器は、無酸素室として改造することができます。可能な限り小さいコンテナを選択するように注意してください。小さ ​​な容器は、より高速、低酸素環境を作成します（ 図4）の水浴中に収まるように簡単です。 蓋の上に二つの穴を作る（ドライバーでまたは鉗子を加熱し、蓋に強制することによって行うことができます）、チューブ（ 図5A）をフィットするプラスチックまたは金属のコネクタを挿入します。水の下に配置することができ、接着剤を使用し、またの動きを避け、乾燥した後に、ハードを取得コネクタひいては漏れ（ 図5B）の可能性を低減。 それは（ 図4）を完全に浸漬されるように、容器を水浴中に配置されるべきである。コンテナを浸漬すること、ボトル重量やダイビングの重みを使用しています。 チューブ接続の1つは、ガス混合物および他のチューブが容器は外部環境（ 図4）から密封されるように、それは水の下に残されるべきであるため、圧力逃がしとして作用する導入するために使用される。 空気組成は、カスタムメイドガス、マスフローコントローラまたは所望のガスを混合する任意の装置を用いて調節することができる。高流量が過剰に蒸発を作成できるように、ガス流は、制御されるべきである。例えば、250mlの容器内に、ガスを100ml /分ウォームの良好な空間および適切なフラックスを提供する。 それらはガスであり、aに対して透過性とすることができるように、チューブの長さは、最小に保たれるべきであるllowing O 2の入り口。これらの材料はガス交換に透過性であるように、シリコーン、タイゴンチューブを使用しないようにすることが重要です。私たちは、ポリプロピレンまたはナイロンチューブを好む。ガラスや金属管はよくガスを維持するだけでなく、で動作するように困難です。