Avaliando a progressão do ciclo celular de tronco neurais e as células progenitoras no desenvolvimento do cérebro do rato após estresse genotóxico

Durante o desenvolvimento do cérebro embrionário, de neurónios de projecção do córtex cerebral são gerados na zona ventricular, um epitélio pseudo composto de diferentes tipos de estaminais neuronais e células progenitoras (NSPC) que reveste os ventrículos laterais. Entre NSPC, as células gliais radiais (RGC), que servem como células estaminais neurais, sofrer migração nuclear interkinetic (INM): eles realizam a mitose na superfície do ventrículo e da fase S no limite basal da zona ventricular (VZ) ^{1, 2,3.} Eles podem dividir ou simetricamente para gerar dois RGC ou assimetricamente para gerar um RGC e um neurônio ou uma célula intermediária progenitor (IPC) ^{4, 5.} IPC migrar para uma camada sobrejacente proliferando chamada zona subventricular (SVZ), onde depois de uma última divisão simétrica geram dois neurônios de projeção imaturos ^6-8. Ao contrário do RGC, o IPC não sofrem INM (revisado em ^9). Neurônios recém-gerados Migrcomeu radialmente ao longo das fibras radiais através da zona intermediária (IZ) para chegar ao seu destino final na placa cortical (CP) ^{10, 8.} O timing perfeito de todos estes eventos é essencial para um desenvolvimento cortical correta. Por exemplo, o interruptor de proliferação a diferenciação de populações progenitoras neurais é controlada pela duração da fase G1 ^{11, 12.} O prolongamento da fase G1 assim correlaciona com a diferenciação celular.

Estresse genotóxico, como radiação ionizante, o desenvolvimento do cérebro severamente prejudicar (revisado em ^13). Nós e outros autores mostraram que NSPC são altamente propensos a apoptose induzida por radiação ^{14, 15,16.} As radiações ionizantes induzir rupturas dos filamentos de DNA duplo que são os danos mais graves para células em proliferação. Um componente essencial da resposta a danos do DNA (DDR) em células de ciclismo é a ativação de pontos de controle do ciclo celular nas transições G1 / S ou G2 / M ou durante Sfase (intra-S checkpoint) ^17-21. Eles bloqueiam a progressão do ciclo celular para dar tempo para a reparação de danos ao DNA ou eliminação de células muito danificadas. Consequentemente, a morte celular, bem como a progressão do ciclo celular retardada pode alterar o desenvolvimento do cérebro em resposta à exposição a radiação ionizante ^22-24. Era, portanto, interessante para desenvolver um método para avaliar a activação de checkpoints do ciclo celular em NSPC no cérebro do rato embrionário irradiado.

A progressão do ciclo celular é normalmente seguido usando a incorporação de um análogo da timidina, 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU). BrdU é incorporado durante a fase S do ciclo celular, quando o ADN está a replicar. A utilização de um anticorpo contra BrdU permite posteriormente a detecção de células que estavam na fase S durante o pulso de BrdU.

Um análogo da timidina romance, 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) é detectada por um azida fluorescente. As diferentes maneiras de detectar EdU e B RDU não reagem de forma cruzada ^25, permitindo a detecção simultânea de ambos os análogos de timidina, a qual é útil para o estudo da progressão do ciclo celular. Normalmente, as células são pulsadas com EdU primeiro e, em seguida, pulsadas com BrdU, em que o tempo entre as duas incorporações dura duas horas ^{25, 26.} A adição de BrdU em meios de cultura contendo EdU resulta preferencialmente incorporação de BrdU no ADN com a exclusão de EdU, enquanto que a adição simultânea de EdU ²⁵ com BrdU equimolar ou equimolar metade para os meios de comunicação provoca apenas a incorporação de BrdU ^27. Isto simplifica o protocolo de marcação dupla, eliminando as etapas de lavagem que são normalmente necessários para a remoção da etiqueta a partir do primeiro meio de cultura antes da adição da segunda etiqueta. Este também é de um interesse especial para o estudo in vivo, em que os passos de lavagem não são possíveis, para determinar o momento preciso da entrada na fase S ou saída da população de células.

t "> Recentemente, um método de rotulagem de duplo pulso em cérebro embrionário do rato usando EdU e BrdU ^{23, 24,22} foi desenvolvido para analisar a progressão do ciclo celular e INM de NSPC no útero após a irradiação. Além disso, tem sido demonstrado que, durante fase S, células de camundongo replicar primeiro as regiões eucromatina e, em seguida, a heterocromatina pericêntrica ^28,29,30. Curiosamente, heterochromatin pericêntrica de diferentes cromossomos agrupados em núcleos interphasic para formar focos heterocromática também conhecido como chromocenters e facilmente detectável pela coloração DAPI como focos brilhante. Portanto, os diferenciais Edu e BrdU colorações de eucromatina e chromocenters nos ajudou a analisar com mais precisão a progressão da fase S de NSPC.

Este método permitiu a demonstração da aparente falta de G1 / S checkpoint em NSCP ^22-24, o que é bastante surpreendente, pois o ponto de verificação é suposto ser crítico para a estabilidade do genoma. Vários experimental desenhos com base em várias combinações de edu e BrdU pulsos foram utilizados para analisar a progressão do ciclo celular, no telencéfalo ventral e dorsal. Aqui, damos um exemplo de protocolos para permitir o estudo do dano ao DNA aguda da NSPC no primeiro 4 horas após a irradiação em utero de embriões E14.5 do mouse.