Изучение фаголизосомы биогенеза в живых макрофагов
Abstract
Фагоциты играют важную роль в системе врожденного иммунитета путем удаления и ликвидации вторжения микроорганизмов в их фагосом. Фагосомы созревание является сложным и жестко регулируется процесс, при котором зарождается Фагосомы претерпевает радикальные преобразования с помощью хорошо организованных взаимодействий с различных клеточных органелл и отсеков в цитоплазме. Этот процесс, который имеет важное значение для физиологической функции фагоцитирующих клеток по наделяя фагосом с их литических и бактерицидными свойствами, достигает кульминации в слиянии фагосом с лизосом и биогенеза фаголизосомах который считается последним и критический этап созревания для фагосом. В этом докладе мы описываем метод, основанный изображений живых клеток для качественного и количественного анализа динамического процесса лизосом в фагосомы Content Delivery, который является отличительной чертой фаголизосомы биогенеза. Этот подход использует микрошарики IgG-покрытые качестве модели для phagocytosis и флуорофорные-сопряженных декстрана молекулы как просвета лизосом грузов зонда, для того, чтобы следить за динамический доставки контента lysosmal к фагосом в режиме реального времени в живых макрофагов с помощью покадровой обработки изображений и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Здесь мы подробно описать фон, подготовительные шаги и шаг за шагом экспериментальную установку для включения легко и точно развертывание этого метода в других лабораториях. Наша Описанный метод является простой, надежный, а главное, может быть легко адаптирована для изучения phagosomal взаимодействия и созревание в разных системах и при различных экспериментальных условиях, таких как использование различных типов фагоциты, с потерей функции экспериментов, различных датчиков, а фагоцитарные частиц.
Introduction
Профессиональные фагоциты, включая макрофаги, играют решающую роль в иммунной системе. Помимо того, что первая линия обороны в врожденной иммунной системы, они также играют важную роль в активации адаптивного иммунитета через их сигнализации и антигенпредставляющих роль 1-3. В то время как функция профессиональных фагоцитов многогранна, Фагосомы созревания является критическим основой бактерицидного и антигена функции обработки профессиональных фагоцитов 4,5. После опосредованного рецептором охвате и поглощения в фагоцитарной цели, такие как бактерии, возникающий Фагосомы проходит через сложную и хорошо организованной последовательности взаимодействия и обменов с отсеках эндоцитотического сети и нескольких других клеточных органелл 6. Характер соединений обменялись с этими клеточными лиц, а также регулирования и сроки событий слияния определяет просвета phagosomal среду и фагоМембрана состав OMAL и, таким образом, 7, судьба созревания фагосомы 8.
Физиологическое значение фагосомы созревания иллюстрируется разнообразными стратегиями, используемыми различными внутриклеточных патогенов вырваться из, ареста или подорвать фагосомы созревание 9. Большинство из этих стратегий прямо или косвенно предотвратить окончательное и критическую стадию процесса созревания фагосомы: слияние фагосомы с конца эндосомный / лизосомальных отсеков, которые придают им основной массы гидролитических ферментов и антибактериальными факторов зрелой фагосомы 7 , 8,10. Анализ этой заключительной и важный шаг, следовательно, может предоставить нам сильных показателей о состоянии созревания фагосом и если естественное физиологическое состояние положительно или отрицательно быть затронуты в конкретных экспериментальных условиях, что в настоящее время используются.
Покойный эндосомный / лизосомные отсекс, как правило, рассматривается как терминал отсеки эндоцитотического пути, определенные и отличающиеся от ранних эндоцитотических отсеков наличием различных, Стадия конкретных, молекулы-маркеры. Например гидролитических ферментов или мембранные компоненты, такие как Лизосомные связанных мембранных белков (ламп) среди других 11. Терминал эндоцитотический отсеки-отныне называют просто лизосом-также служить в качестве основного места для заключительных этапах пищеварения в конце фагоцитарной / эндоцитотический пути 12. Таким образом, неперевариваемые зонды могут быть загружены через эндоцитоз и макропиноцитозом из внеклеточной среды и транспортируется через эндоцитоза пути к лизосом, где она накапливается 13,14 после выполнения определенного цикла поглощения и охоты. Флуорофора, конъюгированным зонды для флуоресцентной микроскопии, такие как органического полимера неперевариваемые декстрана обычно используются в качестве endocyticprobes 15-17.
<p class = "jove_content"> В этом методе, описаны использование микросфер, покрытых IgG-фагоцитарной как груза для исследования фагосомы созревание путем анализа доставку контента лизосом просвета в фагосом. С помощью флуорофора-сопряженных декстрана зонд как легко выявляемого маркера лизосом в прямом эфире костного мозга, полученных макрофагов (BMM) и покадровой видео изображения с конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, мы следуем динамический процесс доставки грузов в фагосом с высоким временное разрешение. Затем мы опишем, как собранные данные покадровой обработки изображений можно оценить с помощью с открытым исходным кодом и свободно доступного программного обеспечения для анализа изображений, Фиджи (или ImageJ), статистически проанализированы с помощью Microsoft Excel и представлены с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 14,18.После описания нашего метода, аналогичные эксперименты могут быть разработаны с использованием модифицированных параметров и факторов, чтобы исследовать их влияние на фагосомы созревания; практически любой OTее тип прикрепленных первичных или клеточных линий клеток фагоцитов, генетическая потеря экспериментов функциональных включая ген нокаут и нокдаун, мутанты или выражение слитых белков, фагоцитарных-мишеней, соединений Microbead покрытия, эндосомный / лизосомальных зондов и факторов такого цитокины, химические ингибиторы или миРНК среди других все переменные, которые могут быть применены к основной подход, предусмотренный этим методом.
Определим цели и основные требования этого метода следующим образом:
- Цель метода: для прямого, количественный и качественный наблюдение и анализ фагосомы созревания с высоким временным разрешением в живых фагоцитарные клетки.
- Фагоцитарная грузов: надлежащим покрытием микрочастиц или биологической мишенью. Здесь мы используем IgG покрытием микрочастиц сферической полистирола 3 мкм, которые легко усвоенные через Fc-γ рецепторов опосредованного фагоцитоза. Кроме того, любой микроорганизм или микрофона с покрытиемroparticle для которых фагоцитарная рецептор присутствует в клетках могут быть использованы.
- Фагоциты: Приверженец фагоциты, выражающие соответствующие фагоцитарные рецепторы. Здесь мы используем мыши первичные BMMs которые обильно выразить FC-γ рецепторы. В качестве альтернативы, можно использовать дендритные клетки (DC), моноциты или фагоцитирующих эпителиальные клетки или их генетические мутанты или нокаут-варианта.
- Лизосомные грузов: флуоресцентно меченных лизосомные зонд. Здесь, Texas Red-конъюгированные 70000 кДа декстран (Dex70kD) используется в качестве просвета грузом лизосомах. Кроме того, любой флуоресцентно детектируемый маркер клеточной органеллы, или отсека, или соответствующего зонда для phagosomal свойств, таких как кислотность или деструктивного мощности, может быть использован для изучения прогрессирования фагосомы созревания.
- Влияние факторов: Например, сигнальных молекул, химических соединений, генной нокдаун или временную экспрессию мутантных белков может. Здесь мы Forgодин использование такого фактора для простоты, но для недавнего примера с мутантной экспрессии белка и бросовым влияющих факторов размещается на Kasmapour др.. 18 Любой фактор, который может повлиять на фагоцитоз или обстоятельства и мобильность фагосом и / или отсеки, которые взаимодействуют с погашением фагосом потенциально могут быть использованы.
Protocol
Representative Results
Discussion
В следующем разделе мы обсудим важные этапы предложенного метода и его ограничения. Кроме того, мы подключим некоторые из распространенных проблем, с их решениями, ввести возможные изменения и рассмотреть преимущества нашего метода, а также подходящие дополнительные методы для этого …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов биологической лаборатории фагосомы за критическое прочтение рукописи. Эта работа поддержана грантом Гельмгольца Молодая следователь (инициатива и Сетевые средств из Гельмгольца) и Программы Priority SPP1580 Грант немецкого исследовательского совета (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
References
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
- Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
- Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
- de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
- Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
- Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
- Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
- Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
- Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
- Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
- Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
- Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
- Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
- Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Aziz, M., Yang, W. -. L., Wang, P., Coliganet, J. E. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. 14, (2013).
- Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
- Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -. M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).
