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生物学

의 정렬<em> 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)</em복잡한 개체 파라 메트릭 분석기 및 분류기를 사용하여> 셀 펠렛

Published: February 13, 2014
doi:
10.3791/51178
, , ,
1Microbial Biotechnology, Institute Biology Leiden,Leiden University, 2Microbiology, Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation,Utrecht University

Summary

액체 성장 스트렙토 배양 크기 이질적인 균사체 펠렛을 특징으로한다. 우리는 여기에서 분석하는 방법을 서술하고 높은 처리량의 방식으로 정렬 펠릿. 이러한 펠릿을 성장 이질성을 이해하고 제어하는​​ 단서를 제공 할 추가적인 분석을 위해 사용될 수있다.

Abstract

Streptomycetes 효소 및 항생 물질의 생산을위한 산업에서 사용되는 필라멘트 토양 박테리아이다. 생물 반응기에서 재배 할 경우,이 생명체의 크기는 이질적인 펠릿으로 알려진 상호 균사의 네트워크를 형성한다. 여기에 우리가 분석하는 방법을 설명하고 종류 균사체 펠렛은 복잡한 개체 파라 메트릭 분석기 및 분류기 (COPAS)를 사용하여. 자세한 설명은 기기와 데이터의 통계적 분석의 기본적인 사용을 나타낸다. 우리는 또한 이러한 RNA 또는 단백질 함량의 분석과 같은 다운 스트림 처리를 가능하게하는 사용자 정의 설정에 따라 펠릿을 정렬 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하여 기계 장치 기본 이종 성장에 태클을 할 수 있습니다. 이것은 생산성 펠릿의 크기와 관련이 있다는 사실을 고려하여, 세포 공장으로 streptomycetes 향상을위한 수단이 될 것입니다.

Introduction

Streptomycetes는 사상 토양 아니라 항생제를 만들기 위해 자신의 능력에 대해 알려진 박테리아뿐만 아니라 면역 억제제 나 곰팡이 감염이나 암 1,2을 방지하는 데 사용할 수있는 화합물이다. 또한, 이러한 유기체는 산업 애플리케이션 (3)의 넓은 범위에 대해 관심있는 효소를 생산한다. 이러한 상업적으로 흥미로운 화합물의 대부분은 생물 반응기에서 생산됩니다. 생물 반응기에서 streptomycetes의 성장은 대단히 짧은 시간 또는 펠렛으로 알려진 상호 균사의 복잡한 구조의 형성이 특징입니다. 이러한 다세포 구조는 사이즈 4에 대한 매우 이질적인 및 대장균 또는 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) 등의 단세포 박테리아보다보다 백만 배 더 큰 크기에 도달 할 수 있습니다. 이성이 자연적인 생물학적 시스템 5에 유리한 특성으로 간주되지만, 그것은 산업의 생산 함정으로 간주됩니다. 바이오원자로 cultivati​​ons가 가장 높은 수율을 얻을 재현하고 제어해야합니다. 생물 반응기에서 펠렛 형태의 각각의 역할의 상세한 이해는 세포 공장 등 streptomycetes을 향상시키는 것이 중요하다.

유동 세포 계측법은 일반적 인구 6에서 개별 세포를 분석하는데 사용된다. 유동 세포 계측기를 동시에 (같은 크기, 밀도 및 다색 형광 등) 세포의 특성을 측정함으로써 multiparametric 정보를 취득 할 수있다. 이러한 방법으로, 세포의 특성을함으로써 우리의 문화 내에서 이질성의 이해와 셀 6의 독특한 집단의 존재에 기여 상관 관계 될 수있다. 보다 전문적인 장비는 사용자 정의 매개 변수에 따라 가능한 세포를 정렬 할 수 만들었습니다. 예를 들어, 돌연변이 검사를 할 수 있습니다. 정렬 후, 이러한 돌연변이 세포가 더 특성화 재배 할 수 있습니다. 이것은 이미 다른 사람의 사이에, 유용한 것으로 입증되었습니다,변종 7,8의 생산성을 향상시킬 수 있습니다. 유동 세포 계측기의 노즐은 일반적으로 약 10 ㎛의 최대 직경이 세포의 통과를 위해 수 있습니다. 따라서 streptomycetes의 펠릿을 일정한 유동 세포 계측기로 분석 될 수 없다. 그러나 이들은 복합 오브젝트 파라미터 분석기 및 분류기 (COPAS)으로 분석 할 수있다. 일정한 흐름 세포 계측기와 마찬가지로 COPAS는 높은 처리량 방식으로 입자의 multiparametric 데이터를 수집 할 수 있습니다. COPAS의 유형에 따라 10-1,500 μm의 입자 크기를 분석 할 수있다. 또, 예컨대 DNA, RNA 또는 단백질의 분리 등의 재배 또는 하류 분석에 사용될 수있는 개별 입자의 선별을 허용한다. COPAS은 초기에 선충 예쁜 꼬마 선충 (9), Drosophila의 배아 및 유충 (10) 작은 다세포 생물의 분석 및 정렬을 위해 설계되었습니다. 악기는 제브라 피쉬 (11)에 사용 된차 사상균 (12, 13)에 대한. 후자의 생물은 사상 박테리아에 의해 형성된 그보다 더 큰 균사체 펠렛을 형성한다. 우리는 최근에 COPAS의 사용도 streptomycetes 4 가능한 것을 증명하고있다. 우리는 여기에 크기에 따라 알약을 정렬하는 방법에 대한 세부 사항을 포함하여, 스트렙토 coelicolor의 펠릿 이질성을 평가하기 위해 COPAS를 사용하기위한 실험 절차를 설명합니다. 이 방법은 다른 펠릿 형성 streptomycetes의 분석에 이용 될 수 있다는 점에 유의하시기 바랍니다.

Protocol

이틀 된 액체 성장 문화 종류의 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 알약을 분석하는 절차를 개략적으로 그림 1에 표시됩니다. 방법에 대한 세부 정보는 다음과 같습니다. 1. (미디어 및 버퍼의 준비 포함) 성장 배 인산염 완충 생리 식염수 1 L 준비 (PBS를, 80g의 NaCl, 2g의 KCl, 14.4 g 2 HPO 4, pH를 7.4로 조정 증류수 1 L에 2.4 g의 KH 2 PO 4 나). 사용시 PBS의 1 L를 얻기 위해 증류수 900 ml로 10 배 PBS 100 ㎖를 추가합니다. YEME 매체의 1 L를 준비 (3g 디프 효모 추출물, 5g 박토 펩톤, 3g Oxoid 맥아 추출물, 10g 포도당, 340g의 자당, 1 L에 증류수까지) 및 2.5 M MgCl2를 100 ㎖. 고압 증기 멸균하여 두 솔루션을 소독. 다른 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 미디어 4,14를 사용할 수 있습니다. 100 ㎖의 YEME 매체 및 0.2 ml의 2.5 M MgCl2를 추가멸균 된 250 ㎖의 삼각 플라스크 금속 코일 스프링을 탑재. 공부하는 세균 샘플만큼 플라스크를 준비합니다. 106 포자 / ㎖의 포자 농도를 구하는 스트렙토 10 8 포자 각 플라스크에 접종한다. 180 rpm으로 흔들어 동안 30 ° C에서 2 일 동안 박테리아를 성장. 2. 샘플링 멸균 5 ML 피펫을 사용하여 15 ML 팔콘 튜브에 각 문화에서 5 ㎖ 샘플을 전송합니다. 샘플은 전체 문화를 대표하도록 샘플을 복용하는 동안 부드럽게 진탕 배양. 샘플 COPAS 즉시 분석하는 경우에는 샘플 준비 단계를 수행 할 필요가 없습니다. 얼음에 샘플을 유지하고이 프로토콜의 3.1 단계로 진행합니다. 샘플은 이후 시점에서 분석 할 때, 단계 2.3-2.5이 프로토콜에 설명 된 펠릿을 고정한다. 제대로 분석가 후 청소하지 않을 경우 고정도 튜브 시스템에서 박테리아의 성장을 방지합니다에스. 포름 알데히드는 다운 스트림 분석을 방해하지 않습니다와 그 고정을 확인합니다. 예를 들어, RNA는 포름 알데히드로 고정 후 곰팡이 알약에서 분리 할 수​​ 없습니다. 대조적으로, RNA 성공적 70 % 에탄올 (12)와 고정 후 단리 하였다. 샘플 5 ㎖에 37 %의 포름 알데히드 600 μl를 추가하고 튜브 배를 반전 섞는다. 30 분 동안 얼음에 샘플을 고정합니다. 원심 분리기 10 분 동안 4 ° C에서 고정 된 회 전자에 2,500 XG에 샘플. 조심스럽게 뜨는을 제거하고 PBS의 5 ㎖로 알약을 씻으십시오. 펠렛은 PBS 2 배로 세척 그래서 2.4 단계를 반복합니다. 샘플은 몇 주 동안 4 ° C에서 PBS에 저장할 수 있습니다. 3. COPAS 분석 COPAS 플러스, 펌프, 컴퓨터와 488 nm의 아르곤 레이저가 켜져 있고 Biosort 소프트웨어를 시작하고 있는지 확인하십시오. 켜져 있지만, 레이저는 여전히 대기 잠정 될 것이다. 칼집 유체 병이 가득하고 있는지 확인폐기물 병이 비어 있습니다. 에에 대기 모드에서 488 nm의 아르곤 레이저를 전환 한 후 'START'와 'RUN'을 클릭합니다. 레이저가 켜져있을 때 후 약 60 초, '완료'를 클릭합니다. 압력 게이지를 확인합니다. '칼집'에 대한 압력은, '샘플', '분류기'와 '청소'으로 각각 4.0, 0.5, 2.7, 10.9을 읽어야합니다. 다음으로 '압력 OK'에 확인란을 클릭합니다. 시스템은 유동 세포를 소수가 사용 준비가 된 것입니다. 기본 설정은 11에서 '지연'과 '폭'7 간주됩니다. 임계 값은 시간의 비행을 대표하는 TOF와 함께, 'TOF 최소'에 대한 '신호'에 대한 50, 40로 설정되어 있습니다. (완전성에 대한 모든 '이익'이 1로 설정되고, 트리거는 2.50 ㎒의 선택 '스캔 속도를 선택합니다'EXT (소멸)에 그리고 아래의 '설정'탭에서 설정 우연의 일치가 '강화'로 설정되어 있습니다.). 샘플 컵에서 남은 물을 제거D 함께 (50 ㎖ 정도) PBS와 단계 2.2 컵 2.5에서 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 샘플의 0.1 ML를 추가합니다. 확인 샘플 컵이 제대로 닫혀 있습니다. 데이터 수집을 시작하려면 '획득'을 클릭합니다. 초당 30 ~ 50 이벤트 사이에서 얻을 흐름 속도를 관리 할 수​​ 있습니다. 흐름이 너무 높으면, 시료 컵에 PBS를 추가한다. 유속이 너무 낮 으면, 더 많은 샘플을 추가한다. 적어도 2,500 이벤트는 클릭 'STOP'을 수집합니다. 모든 데이터를 클릭 '스토어'를 저장하고 이후의 통계 분석을 위해 파일을 저장합니다. Biosort 소프트웨어에만. txt 파일은 후속 분석을 위해 사용되는 그중, 네 개의 파일에 데이터를 저장할 것이다. 50 ML의 주사기와 물 2 배 세척과 샘플을 제거하여 샘플 컵을 청소합니다. 모든 샘플이 분석 될 때까지 반복 3.7-3.10 단계를 반복합니다. 4. 데이터 분석 . txt 파일을 열고 (예 : MS Excel 용 사용) (25)보다 낮은 EXT 데이터를 폐기합니다. 이4,12 (아스 페르 길 루스에 니제르 (150)보다 낮은 EXT 모든 데이터가 삭제됩니다) 파편과 느슨한 균사 조각에 해당한다. '. TXT'다음 (: 많은 데이터 파일이에서 사용할 수있는 프로그래밍 언어 R에 자동화 할 수있는 일반에 하나의 컬럼에 파일을 모든 TOFs을 저장 http://www.r-project.org ). 확인 SciLab은 (버전 5.3.2 이상 버전 http://www.scilab.org/부터)에서 함께 설명서에 사용할 수있는 'fittools'도서관,,,와 함께 설치되어 있는지 확인합니다 : http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual % 20fittools.pdf SciLab를 시작하고 데이터를 모델링하는 fittools 라이브러리의 필요한 기능을 실행합니다. 즉 : (한 번만 필요) 사용 설명서에 표시된 fittools 라이브러리를 설치합니다. fittools 라이브러리를로드합니다. SciLab로 데이터 ( '. TXT'파일)을 참조하십시오. (자연 로그 기본 로그 함수 인) 데이터를 변환 로그. 데이터에 2 인구의 모델을 장착한다. 히스토그램 및 모델 (옵션)와 함께 그래프를 그린다. 데이터 (1000 회 반복)를 부트 스트랩. 부트 스트랩 데이터 세트에 모델을 장착한다. 신뢰는 5 매개 변수의 추정 구간들 받으세요. 이는 인구, 그들의 2 수단 (μ 1, μ 2) 및 첨부 표준 편차 (α 1, 2 α)의 참여 비율 (P)에 대한 정보를 제공합니다. 또한, 95 %의 신뢰 구간은 12,13,15를 (1,000 회 반복)를 부트 스트랩 한 후 모델을 재 장비에 의해 결정됩니다. 수단의 신뢰 구간이 중복되지 않고 (P)의 신뢰 구간이 0.025-0.975 사이에서있을 때 데이터 집합은 정규 분포의 두 개체군의 조합으로서 설명 될 수있다. (일을 참고큰 알약의 참여가 1 인 반면 작은 펠릿의 참여 부분에서 p는 것입니다 -. P) TOF 및 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛의 직경 사이의 관계는 0.57 × TOF + 159 μm의 4 같습니다. 경우 두 집단은 상부로 COPAS의 매개 변수를 정렬로 사용하는 평균 TOFs을 발견하고 이후 크고 작은 알약을 정렬 하한. 또한 다른 정렬 파라미터는 사용자의 요구에 따라 선택 될 수 있음을주의한다. 5. 펠렛 정렬 단계 3.7에 설명 된대로 정렬 할 필요가 스트렙토 샘플을로드합니다. '제한을 정렬'으로 설정하고 최소 (LO) 및 최대 (HI) TOF 값에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 또한, '지역'다음 원하는 크기 나 특성을 가진 펠릿을 선택하는 '게이트 영역을 정의'를 선택하여 영역을 설정합니다. 50 ML 튜브에 배치정렬 매개 변수를 충족 여러 개의 알약을 수집합니다. 다르게는, 마이크로 타이 터 플레이트는 개별 펠렛을 정렬하는데 사용될 수있다. 여러 펠렛 (10 4 -10 5) DNA 및 단백질 추출을 위해 필요합니다. 단일 펠릿은 유전자 발현의 qPCR 분석을 위해 충분하지만, 체류 펠릿 RNA 시퀀싱을 위해 필요하다. 결정하고 정렬 할 필요가 알약의 수를 설정하고 선택한 매개 변수에 대한 정렬 정렬 수동 '을 클릭합니다. 펠릿의 설정 량에 도달하면, 자동 정렬이 종료된다. 샘플 컵에서 50 ML의 주사기와 샘플을 통해 왼쪽을 제거하고 물 2 배와 컵을 세척한다. 다른 샘플을 정렬 할 필요가있는 경우를 반복 5.1-5.5 단계를 반복합니다. 종료하기 전에 COPAS 남은 알약을 제거하고 70 % EtOH로 및 / 또는 물에 2 % 차아 염소산 샘플 컵을 청소하기 위해 물을 샘플 컵을 씻어. 전체 시스템을 청소하고, 물이 반복 염소화 물 샘플을 실행. 빈 t그는 용기 청소를 오버플로 또는이 컨테이너에있는 필터를 교체합니다. 완료되면, 시스템에서 압력을 해제하는 'STOP'을 클릭합니다. 모터 정지 프로그램을 닫고 '정화하지 않고 종료'를 클릭합니다. 그런 다음 컴퓨터, COPAS, 레이저 및 펌프를 끕니다.

Representative Results

스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛 COPAS 측정 Streptomycetes 사이즈의 넓은 범위가 액체 문화 균사체 펠렛을 형성한다. 펠릿의 크기 분포를 분석하기 위해 2 일된 액체 성장 스트렙토 coelicolor 배양은 1mm의 노즐을 탑재 COPAS 플러스 프로파일 러를 사용 계측법 큰 입자 흐름을 행 하였다. 일반적인 COPAS 출력은 그림 2A 시각화 등의 산점도이다. x-축은 펠릿 크기 (즉,이 레이저 빔을 통과하는 더 큰 펠릿 오래 걸린다)와 상관되는, 비행 시간 형 (TOF)을 나타낸다. y 축은 객체의 광학 밀도를 나타내는 소멸을 보여준다. 산점도에서 각 점은 레이저 광을 통과 한 펠릿 즉, 개별 이벤트에 대응한다. 샘플이 너무 집중되는 때 (레이저는 100 개 이상의 이벤트 / 초를 감지 할 때 예) 중요한 것은, COPAS 자주 개인 (P)을 감지하는 데 실패ellets. 이것은 너무 높은 거짓 TOF 값에 이르게한다. 샘플을 희석하는 것은 더 희석이 더 이상 영향 TOF하지 않습니다 시점까지의 평균 TOF 값을 줄일 수 있습니다. 약 100 펠릿 / 초 분석 때이 점에 도달한다. 히스토그램에 데이터 포인트를 플롯하면 크기는 일반적으로 (그림 2B)를 배포하지 않는 것을 나타냅니다. 분포는 오른쪽으로 기울어 진 것으로 보인다. 데이터 세트를 변환 로그도 정규 분포 (그림 2C)로 연결되지 않았다. 크기 분포는 데이터가 수학적으로 12,15 모델링, 두 정규 분포의 혼합물을 가정하여 설명 할 수 있는지 여부를 평가하기 위해. 모델링은 참 크기 분포는 펠릿의 두 개의 별개 집단의 존재를 전제로하여 설명 될 수 있다는 것을 나타냈다. 작은 펠릿의 인구는 248 μm의 평균 크기를 가진 모든 펠릿의 92 %로 구성되어있는 동안 큰 화소의 인구(모든 펠릿의 8 %)가 319 μm의 평균 크기를 가지고 (두 집단이 참가 비율은 2.5-97.5 % 사이에있을 때 존재하는 것으로 간주됩니다 참고) 할 수 있습니다. 크기에 따라 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛의 정렬 크고 작은 펠릿의 인구에서 마이크로 콜로니를 분류했다. 이를 위해, 두 집단의 평균 크기는 펠렛 정렬하는 경계를 정의하는 데 사용 하였다. 319 μm의보다 큰 알갱이가 큰 펠릿 인구 (그림 3)에서 간주 된 반면, 두 가지 크기의 중첩 부분에서 펠릿의 정렬 제한 할 수 있도록 248 μm의보다 작은 펠렛은, 작은 펠릿 모집단으로 간주되었다 분포. 정렬 된 펠릿의 현미경 분석은 별개의 크기 (그림 3)을 보여 주었다. 수집 된 펠릿을 추가 DNA, RNA, 또는 단백질 아이솔레이션을 위해 사용될 수있다. <IMG의 고도 = "그림 1"FO : SRC = "/ files/ftp_upload/51178/51178fig1highres.jpg"SRC = "/ files/ftp_upload/51178/51178fig1.jpg"/> : 콘텐츠 폭 FO = "5 인치" 그림 1. COPAS를 사용하여 스트렙토 펠릿을 측정하고 분석 할 수있는 실험 장치의 도식 표현. 자세한 내용은 실험 절차를 참조하십시오. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. 액체 성장 스트렙토 문화 그림 2. 펠렛의 크기 이질성. 2 일 된 S.의 COPAS 분석 coelicolor의 YEME 문화 (A)는 (비행 값을 시간으로 표시) 펠렛의 크기는 일반적으로 배포되지 않음을 나타냅니다D (B) 및도 지도록 때 로그 변환 (C). 대신, TOF에 차이 (따라서 크기) 펠릿의 두 집단이 검출 된 것은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3. (파란색으로 표시) 319 μm의보다 큰 크기의 알갱이가 큰 알약으로 간주 된 반면, 크기에 따라 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛의 분류. 펠렛 크기 (분홍색으로 표시)보다 작은 248 μm의는, 작은 알갱이로 간주되었다. 현미경 분석은 사이즈의 차이를 확인 하였다. 이 크기는 TOF와 D 사이의 관계를 설명하여 로그 변환 된 데이터를 통해 계산 한 참고0.57 × TOF + 159 μm의에 해당 스트렙토 펠릿의 iameter은. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

클론 인구 6 이질성에 대한 우리의 이해에 기여 단일 세포의 많은 수의 고속 분석을 가능하게했습니다 유동 세포 계측법. 일반 유동 세포 계측법은 streptomycetes 및 곰팡이의 균사 다세포 펠릿의 분석에 적합하지 않습니다. 우리의 작업은 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 펠렛의 높은 처리량 분석 COPAS를 사용 가능한 것을 보여 주었다. 여기에 설명하는 절차는 간단하고, 빠르고, 높은 재현성이다. 기기의 동작시주의해야 할 중요한 매개 변수 (스텝이 프로토콜 3.8) 100 이벤트 / 초를 초과하지 않아야 흐름 속도입니다. 펠릿 농도, 따라서 또한 유속이 너무 높게되면 기기가 개별 펠렛을 감지하지 못하기 때문에, TOF 값이 잘못 계산 될 것이다. 충분히 PBS를 첨가하여 시료를 희석하면이 문제를 극복한다.

제한
COPAS 플러스 사용 D 여기에 30-700 μm의에 이르기까지 크기로 입자를 측정하기에 적합하다 1mm의 노즐의 직경을 갖는다. 이 노즐은 따라서 streptomycetes에 의해 형성된 펠릿을 측​​정 할 수 있습니다. 사상균의 경우 마이크로 콜로니 COPAS 플러스의 일반적인 적용 가능성을 제한하는, 더 클 수있다. COPAS XL 크기는 1,500 μm의 최대 입자를 측정 할 수 있지만 직경의 낮은 범위의 감도는 COPAS 플러스에 비해 적습니다. COPAS 플러스 및 COPAS XL 모두 30 μm의보다 작은 입자를 분석 할 수 없습니다. 이것은 개별 미생물 포자 또는 세포를 분석 할 수 없다는 것을 의미한다. 또한, COPAS 정확하게 포자 세포 또는 아주 작은 마이크로 식민지의 작은 집계를 분석 할 수 있습니다. 이 경우, 정규 셀 분석기가 사용되어야한다. 이 제한은 1-1,500 μm의 범위에서 입자를 분석 할 수있는 연합 Biometrica의 Biosorter에 의해 극복된다. 구매 상품 그러나 높다.

T "> 문제 해결
COPAS는 조작하기 쉬운 강력한 도구이다. 그러나, 때로는 펠렛 샘플 컵에 샘플을로드하고 측정을 시작하면 검색되지 않습니다. 원인은 일반적으로 쉽게 '깨끗한'명령을 가압에 의해 해결 될 수있는 항목이 막힌 관이다. 이것은 샘플 컵에 다시 튜브 시스템에서 펠릿을 강제 할 것이다. 다른 이유는 뚜껑이 제대로 샘플 컵에 배치되지 않도록 할 수 있습니다. 이것은 압력 손실 및 펠렛을 검출 수반 장애에 이르게한다.

의의 및 향후 방향
우리는 여기에서 펠릿 크기의 분석에 초점을 맞추고 있지만, COPAS 설정도 분석 할 수와 종류의 형광 및 밀도에 기반하고 있습니다. 형광 검출은 GFP로 기자를 기반으로 유전자 발현을 분석하는 가능하게한다. 또한, 세포의 조성물을 평가할 수있다. 더욱 강력한 이러한 매개에 따라 알약을 분리하는 옵션입니다TERS. 정렬 펠릿은 모든 오 믹스 연구 등의 다운 스트림 분석, 사용할 수 있습니다. 사실, 우리는 이전에 60,000 대와 20 만 작은 알약을 정렬하고 프로테옴 크고 작은 펠릿 4 사이에 유의 한 차이 것을 보여 주었다. 이 기술은 따라서 세포 공장으로 streptomycetes을 개선하기 위해 새로운 단서를 제공한다.

COPAS 기술의 주요 장점은 시간입니다. 세포 펠렛에 대한 이전의 연구는 현미경을 사용하여 수행하고, 이것은 수백 16 개까지 분석 할 수있는 펠릿의 수를 제한 하였다. 현미경 연구는 이미 액체 성장 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces) 문화 (16)의 펠릿의 두 집단의 존재를 제안했다. 실제로, 펠렛이 집단은 상이한 streptomycetes 4의 다수에 관계없이 배양 조건의 검출 하였다. 이 크기 이질성은 사상균 streptomycetes에 한정되지 않고, 또한 사상균 12에서 관찰되었다 </ SUP>. 모든 경우에, 이성의 기본 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. 알약을 정렬 할 가능성이 크기와 형광에 따라 이러한 메커니즘을 해명하는 가능하게한다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Copas PLUS Union Biometrica PLUS Large particle flow cytometer including lasers and software
NaCl Sigma Aldrich S3014 PBS component
KCl Sigma Aldrich P9541 PBS component
Na2HPO4 Sigma Aldrich S3264 PBS component
KH2PO4 Sigma Aldrich P9791 PBS component
Difco Yeast Extract BD Biosciences 210933 Media component
Bacto Peptone BD Biosciences 211677 Media component
Oxoid Malt Extract Fisher Scientific OXLP0039B Media component
Glucose Sigma Aldrich G8270 Media component
Sucrose Sigma Aldrich S9378 Media component
MgCl2.6H2O Sigma Aldrich M2670 Media components. Add after autoclaving.
Formaldehyde Solution Sigma Aldrich F8775 Fixation of pellets
Sodium Hypochlorite Solution  Sigma Aldrich 71696 For cleaning of the instrument
EtOH VWR 20816.367 For cleaning of the instrument
Erlenmeyer Flask (250 ml) Fisher Scientific 214-1132 Culture flask for growing Streptomyces
Springs Verenfabriek De Spiraal Custom-Made Used in culture flask. RVS1.4401/Length 210 mm/Diameter 17 mm/Pitch 5 mm
Sterile Centrifuge Tube (15 ml) Sarstedt 62.554.002
Syringes (50 ml) Sigma Z683698 
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References

  1. Hopwood, D. A. . Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , (2007).
  2. van Wezel, G. P., McDowall, K. J. The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances. Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).
  3. Anné, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. Recombinant protein production and streptomycetes. J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).
  4. van Veluw, G. J., et al. Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).
  5. Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
  6. Davey, H. M., Winson, M. K. Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).
  7. Betz, J. W., Aretz, W., Härtel, W. Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs. Cytometry. 5, 145-150 (1984).
  8. Bell, P. J., et al. A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).
  9. Pulak, R., Strange, K. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. C. elegans: methods and applications. , 275-286 (2006).
  10. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. 遗传学. 175, 1505-1531 (2007).
  11. Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  12. de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., Wösten, H. A. B. Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).
  13. van Veluw, G. J., et al. Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants. Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).
  14. Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. . Practical Streptomyces Genetics. , (2000).
  15. Vinck, A., et al. Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger. Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).
  16. Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis. Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).

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StreptomycesCell PelletsComplex Object Parametric Analyzer And Sorter (COPAS)Mycelial PelletsPellet SizeCell FactoryBioreactorFilamentous BacteriaEnzyme ProductionAntibiotic ProductionHeterogeneous GrowthProductivity

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Petrus, M. L. C., van Veluw, G. J., Wösten, H. A. B., Claessen, D. Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter. J. Vis. Exp. (84), e51178, doi:10.3791/51178 (2014).
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