乳癌の新規トランスジェニックマウスモデル：アデノ-Creを持つ乳管上皮の標的とすることにより、転移性乳癌の開始

全ての動物実験は、ウィスター研究所動物実験委員会によって承認された。 1。トランスジェニックマウスの作製とメンテナンス C57BL / 6マウスと少なくとも10世代戻し交配でフルC57BL / 6バックグラウンド28にLSL-K-RAS tm4Tyj 26と（混合背景にヒトがんコンソーシアムのNCIのマウスモデルから得た）Trp53のtm1Brn 27を飼育。腫瘍転移を追跡するために、品種B6.129X1-GT（ROSA）26Sor TM1（EYFP）のCos / J（フルC57BL / 6背景にジャクソン研究所から入手したLSL-EYFP、）ダブルトランスジェニックLSL-K-RASのG12Dと/ +のp53 のloxP / loxP配列マウス 。 注：トランスジェニックLSL-K-RAS G12D / +のp53 のloxP / loxP配列マウスは、発癌性のK-rasと内在性のp53遺伝子座の転写沈黙対立遺伝子に隣接するloxP部位を持っているのCre媒介切除、発癌性のK-rasの過剰発現時とそう変異体およびp53のアブレーションは、阿智ですeved。 注意：LSL-EYFPマウスはYFP停止カセットが切除された組織内のYFPの発現におけるCre介在切除結果に強化された黄色蛍光タンパク質（YFP）、そのための遺伝子に隣接する終止コドンを含んでいます。 管内注射用のLSL-K-RAS G12D / +のp53 のloxP / loxP配列マウスやLSL-K-RAS G12D / +のp53 のloxP / loxP配列 LSL-EYFPマウスを得るために、トランスジェニックマウスを繁殖。 注意：K-rasのホモ接合性欠失を持つマウスは子宮内で死亡しているため、マウスをLSL-K-RAS G12D / +用のp53 のloxP / loxP配列およびヘテロ接合のためのホモ接合として飼育されています。管内注射のために、少なくとも6週齢のナイーブ処女雌を使用してください。 注：ジェノタイピングホモ接合のためのプライマーは、p53対立遺伝子をフロックスはp53である- T010-FWD（5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 '）およびp53-T011-REV（5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'）。彼らは、391塩基対の野生型対立遺伝子を生成し、p53は461塩基対29,30の対立遺伝子をフロックス。 注：K-rasの突然変異型を検出するためのプライマーはoIMR8273（5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 '）およびoIMR8274（5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'）である。彼らは600BPで検出変異体のバンドを作る。 注：YFPレポーター三重トランスジェニックマウスでは、プライマーは、ROSAカセット（5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 '）、野生型対立遺伝子（5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'）、および共有対立遺伝子（5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTATを検出すること-3 '）フロックス対立遺伝子と野生型対立遺伝子600塩基対のための320塩基対のバンドの増幅をもたらす。 2。外科的準備 75％のエタノールと、外科材料をきれいにし、すべての注射の前後にそれらをオートクレーブ。 動物施設内で消毒室できれいな整頓された実験室のベンチに手術を行う。 75パーセントエタノールに続く広域スペクトル消毒液で手術用顕微鏡のステージやダイヤルなど、すべての表面を拭いてください。 秤量した滅菌生理食塩水中のケタミン（80〜100ミリグラム/ kg）およびキシラジン（8〜10 mg / kg）の混合物の腹腔内注射によりマウスを麻酔。 彼らは麻酔下で行っている間、静かに5分間乱さケージに戻すマウスを置く。この間にウイルス沈殿物を生成（プロトコル3を参照）。 つま先つまんで痛みに対する応答がないことを確認してください。静かに過度の角膜の乾燥を防ぐために、獣医軟膏で麻酔したマウスの目をカバーしています。 低体温症を防ぐには、外科手術中、彼らが回復し始めるまで、 弱火に設定された加熱パッド上に麻酔したマウスを置く。 疼痛の管理のために、マウスは、手術と24時間後にする前に1 mg / kgの皮下メロキシカム管理。 3。ウイルス沈殿物の生成 注意：アデノウイルスベクターは、それらが変形して複製することができないれているが、危険性をもたらす感染症。慎重に、アデノウイルスを処理します。すべての担当者が適切にBSL2ガイドラインに従ってアデノウイルスを処分、管内注入後BSL2エージェントを処理するための機関のガイドラインに従って訓練を受けなければならない。 店のアデノウイルスは、アデノウイルス粒子の2.5×10の3ミリリットル7 PFUで16匹を注入するための十分な4×10 8 PFU各アリコートで凍結-80℃、でウイルスストックを濃縮した。 注射を開始する前に、約15〜20分まで、ドライアイス上アデノずつ保管してください。 注意：ウイルス力価は各サイクルの間で大きく低下すると、繰り返される凍結融解を避ける。 注：アデノウイルス沈殿物は、プロトコルを修正することによって形成されている、以前に記載31。 無菌の分子グレードの水50ml、4℃で無菌状態とストア内の重炭酸ナトリウムおよび244mgのフィルタを有するサプリメントとMEM粉末504 mgの再構成 <李>無菌条件下、4℃で保存中の分子グレードの水及びフィルタ50mlに塩化カルシウム1.5gを添加することによって塩化カルシウム溶液を調製する 10mlの最終体積のための滅菌水中に十分な3％スクロースに4×10 8 pfuのアデノウイルス-Creリコンビナーゼを含有するアリコートを混合する。ウイルスにMEMの34ミリリットルを加え、穏やかに混合します。その後、 塩化カルシウム溶液4mlを加え穏やかに混合し、15〜20分間、室温でインキュベートする。 ストアは沈殿物を形成するのに準備ができるまで、ドライアイス上のアデノウイルス。アデノウイルスの融解を回避し、沈殿物が形成されていない限り、延長回氷や室温で保存する。 注意：これは、アデノウイルスのアリコートを解凍し、すぐに-80℃から取り出した後の沈殿物を作る開始することができない場合は、先行手術にショ糖、MEMおよびCaCl 2を混合することも可能であるショ糖、MEM、カルシウムのこの分量は、アデノウイルスを追加する準備が整うまで、ドライアイス上で保存することができます。 注：ウイルス粒子がほぼ1時間安定である。 各注射の前に、静かにウイルス粒子が混在していることを確認するために、チューブをフリック。 10ミリリットル注射器にウイルス粒子の3ミリリットル（2.5×10 7 PFU）を策定し、管内注射のためにマウスを準備します。 4。ウイルス粒子の管内注入優しくクリーンな解剖顕微鏡の照明されたステージに仰向けにマウスを置きます。余分な光源を用いて腹部側を照らすと、各ニップルを囲む（C57BL / 6雌の上に見える）毛皮の小さな白い斑点が残した4 番目または右9 番目の鼠径部乳腺を探します。 離れて乳頭から髪をクリアするために、注射部位を滅菌する滅菌したエタノールに浸した綿棒で軽く乳首をこする。彼らは見つけることが困難な場合は、ゆっくり脱毛クリームの厚い層を適用したり、乳首を露出するためにハサミを使用しています。 </lI> 乳首をカバーしている角栓 、密な死んだ皮膚細胞の層を、 削除してください 。乳首が露出されると、ケラチンプラグは解剖顕微鏡下で容易に見ることでなければなりません。 細かい外科鉗子で乳首を確保し、角栓を除去して軽い力で引き上げます。 鉗子間の乳首を安定させる。 静かに90°で、ダクト管をカニューレ挿入、鉗子の間に針を挿入します。乳房組織を通って腹側体腔の漿膜への浸透を防止するために、わずかに針（2mm以下）のベベルを越えてニップルを入力する。 深すぎる針を挿入しないでください。注射の適切な深さを確保するためには、ゆっくりと引き上げているように、針のエッジに沿って乳首を策定、ダクトの内腔に挿入した後、針を引き上げる。 注：注射の可視化が困難であるためpracticこのステップのeは、トリパンブルーを使用してお勧めします。 針が適切に乳管に置かれたとき、そっと注射器を持った手の親指と注射器の急落によって（アデノウイルスのCreの2.5×10 7 PFU）ウイルス析出物の3ミリリットルをリリース。液体が追加されるように乳首が少し膨らませる必要があります。 5。マウスのリカバリーそれは麻酔から回復し始めるまで注射の後に戻って加熱パッドの上にマウスを置きます。 マウスが回復した後は、清潔なケージに戻ってそれを置いて、完全に回復し、動きを監視します。 管内注射の24時間後には、皮下に1 mg / kgのでメロキシカムを管理します。 6。監視腫瘍プログレッション拡大や腫れのために30日目で注入乳腺を触診。 一度腫れと拡大乳腺グラン5〜7日ごとに腫瘍の進行を監視dが観察される。 触知可能な腫瘍（約50から60日後、アデノウイルス注射）が表示されたら、腫瘍の成長速度のために3〜4日ごとに腫瘍体積を測定します。 腫瘍体積はマウスの体重の10％を超えたときにマウスを安楽死させる。