Высококачественная общая РНК была подготовлена из клеточных тел моторных нейронов спинного мозга мыши путем лазерного захвата микроперемида после окрашивания секций спинного мозга с Azure B в 70% этанола. Достаточное количество РНК (40-60 нг) восстанавливается у 3000-4000 моторных нейронов, чтобы позволить вниз по течению анализ РНК РНК-сек и qRT-PCR.
Подготовка высококачественной РНК из клеток, представляющих интерес, имеет решающее значение для точного и содержательного анализа транскрипционных различий между типами клеток или между одним и тем же типом клеток в области здравоохранения и болезней или после фармакологического лечения. В спинном мозге, такой препарат от моторных нейронов, цель интереса во многих неврологических и нейродегенеративных заболеваний, осложняется тем, что двигательные нейроны составляют <10% от общей популяции клеток. Для решения этой проблемы была разработана микродиссеция лазерного захвата (LMD). Здесь мы описываем протокол для быстрого восстановления, замораживания и секции спинного мозга мыши, чтобы избежать повреждения РНК эндогенными и экзогенными RNases, а затем окрашивание с Azure B в 70% этанола для идентификации моторных нейронов при сохранении эндогенных RNase ингибируется. LMD затем используется для захвата окрашенных нейронов непосредственно в гуанидин тиоцианат лиза буфера, поддержание целостности РНК. Стандартные методы используются для восстановления общей РНК и измерения ее целостности. Этот материал может быть использован для анализа стенограмм РНК-сек и qRT-PCR ниже по течению.
В тканях млекопитающих, состоящих из нескольких различных типов клеток, появление лазерного захвата микродиссекции (LMD) приборов предоставила возможность выбрать конкретный тип клеток для анализа на уровне РНК или белка. В настоящее время методы усиления и секвенирования следующего поколения позволяют использовать пул общей РНК из нескольких тысяч ячеек для получения относительно тщательной инвентаризации транскриптома, включая оценку относительных уровней РНК и идентификацию различных сращиваемых форм. На сегодняшний день протеомический анализ нескольких тысяч клеток будет достигать вниз через только более обильные виды. Например, мы определили < 1000 из наиболее распространенных белков из 3000-4000 моторных нейронов клеток тела (не показано), и Чжу и коллеги недавно сообщили выявления 2665 белков из 15000 опухолевыхклеток 1. Однако с дальнейшим развитием массовой спектрометрии, вероятно, такие анализы будут распространяться на гораздо большую глубину.
Здесь мы представляем специальный протокол, используемый для LMD моторных нейронных клеток органов из спинного мозга мышей, а затем препарат РНК. Этот протокол был использован в контексте сравнения РНК от моторных нейронов предсимптомных трансгенных трансгенных мутантов супероксид дисмутазы (SOD)1 боковой амиотрофический склероз (ALS) мышей с РНК, подготовленных из дикого типа SOD1 трансгенного штамма как РНК-сек и qRT-PCRпроверки 2. Примечательно, что моторные нейроны, в передней рог серого вещества в спинном мозге, составляют <10% от общей популяции клеток, окруженных морем астроцитов, и как таковой, их транскрипционные профиль не может быть легко деконволюционных исследований всего мозга. Таким образом, подход к лазерному захвату идеально подходит для анализа экспрессии РНК в этих клетках, при этом физиология сохраняется путем быстрого и замораживания шнура после краткой интракардиарной солевой перфузии. Моторные нейроны сомата являются большими и, таким образом, легко обнаружить, здесь с помощью красителя, который имеет сильное сродство кнейронам 3. Кроме того, при таком размере эти клетки обеспечивают относительно большое количество РНК на захваченную клетку. Процедура, используемая, как описано ниже, может быть легко скорректирована для получения других типов нейронных клеток, а также потенциально других типов клеток, специально определенных либо методы окрашивания красителя или окрашивания антителами.
Наиболее значительным показателем успеха этого протокола для производства общей РНК с помощью лазерного микропересасывания ломтиков спинного мозга является значение RIN5. Для образцов РНК из более высоких эукариот значения выше 8,5 регулярно дают высококачественное секвенирование и данные qRT-PCR. Если урожайность низкая, но качество высокое, повторите препарат. Если целостность ниже (даже 7,5-8), однако, лучше найти источник проблемы и попробовать еще раз. Есть много шагов, где что-то может пойти не так, но на самом деле только два источника проблемы – эндогенное загрязнение RNase или экзогенного загрязнения RNase. Первый из них может быть решен на практике, так что время от жертвоприношения мыши до замораживания его O.C.T-встроенный шнур сводится к минимуму. Другой момент в протоколе, где эндогенные RNase может способствовать плохой результат во время подготовки ломтиков. Каждый срез должен быстро прилипать к комнатной температуре ПЕН-слайда, но он будет таять (О.C.Т. становится ясно). Чем быстрее ломтик может быть перерезаны, тем лучше. Криостат, который мы используем, имеет плоские поверхности внутри камеры, которые находятся на -20 градусов по Цельсию, которые мы используем, чтобы быстро заморозить ломтик. Найти аналогичное место в криостат используется и убедитесь, что срез становится непрозрачным снова быстро.
Отслеживание источников экзогенных RNase может быть трудно, потому что Есть так много возможностей. Единственными реагентами, которые используются не только без RNase, являются O.C.T. и Azure B. Если Azure B раньше выполнялся удовлетворительно, попробуйте свежую бутылку O.C.T., хотя этот реагент никогда не был проблемой. Реагенты без RNase также могут быть заменены, даже у другого поставщика. Гораздо более вероятным источником является следователь. В дополнение к тщательной очистке рабочей зоны, часто полезно, чтобы другой член лаборатории следовать вместе и наблюдать все шаги в процедуре. Даже если это тот, кто обычно не выполняет эту процедуру, свежий набор глаз может забрать в противном случае незамеченным источником загрязнения.
Расширение этого протокола для восстановления РНК из других клеток спинного мозга, из клеток спинного мозга от других видов, или от конкретных типов клеток в других органах потребует изменений в нескольких областях, направленных на достижение четкой идентификации клеток, представляющих интерес при одновременном прекращении, или, по крайней мере, минимизации, влияние эндогенных RNase. В протоколе здесь, быстрое удаление и замораживание шнура, в сочетании с окрашиванием Azure B в 70% этанола, позволило как минимизации деградации РНК и легко идентификации моторных нейронов клеток органов. Azure B является устоявшимся гистохимическим пятном для нейронов, которое, как представляется, связываютсяс РНК 3 и был использован для оценки содержания РНК нейронов в образцах вскрытия тканей мозга у пациентов с нейродегенеративнымзаболеванием 6. Примечательно, что окрашивание Azure B не повлияло ни на целостность очищенной РНК, ни на ее способность быть обращенным вспять и проанализированным. Другие красители, такие как cresylфиолетовый 7 и толуидинсиний 8 были использованы в аналогичных протоколах LMD. Сбор тел клеток непосредственно в гуанидин тиоцианат решение, как они были вскрыты при условии, последний шаг, который привел к обычному восстановлению нетронутыми РНК.
Аналогичные подходы можно предусмотреть и для других клеток и органов, признавая, что определение клеток, представляющих интерес при минимизации или, желательно, предотвращение деградации РНК эндогенными РНК является критическим требованием для успешного анализа. В тканях, которые имеют высокий уровень RNase, таких как поджелудочная железа, быстрая обработка и низкая температура были объединены, чтобы позволить восстановление РНК из β-клеток, воспользовавшись их естественной аутофторесценции длявизуализации 9. Процедуры с использованием антител окрашивания для идентификации также былизарегистрированы 10, но не были полностью успешными в наших руках. Наконец, многие модели мыши доступны, которые выражают флуоресцентные белки синтеза(т.е. GFP, YFP, RFP) в клетках, представляющих интерес, которые могут быть использованы для их идентификации в тканях разделов на микроскоп LMD. В самом деле, штаммы мыши мы проанализировали с помощью этого протокола выразить синтез белка между SOD1 и YFP11, и их спинного мозга двигательных нейронов очень флуоресцентные. Мы не смогли, однако, найти набор этанола моет и / или обезвоживания условиях, которые будут одновременно удалить O.C.T., подавляют RNase деятельности, и последовательно поддерживать достаточную флуоресценцию YFP, чтобы визуализация моторных нейронов и их восстановления LMD. Возможно, новый флуоресцентный белок или вариант доступных, который поддерживает флуоресценцию в органических растворителей можно найти, чтобы преодолеть это ограничение.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Джорджа Фарра и членов лаборатории Хорвича за полезные дискуссии. Эта работа была поддержана Медицинским институтом Говарда Хьюза.
Ketamine | Webster Veterinary | 26637041101 | Any source approved by the institutional veterinary service |
Dissection tools (scissors, forceps, etc.) | Any convenient source of high-quality dissection instruments | ||
Cryostat | Leica Microsystem | CM3050S | Other cryostats should be suitable |
LMD6000 B | Leica Microsystem | Other LMD systems have not been tested | |
RNase-free PEN-membrane 2 μm slides | Leica Microsystem | 11505189 | Other slide types have been tested and do not perform well |
RNeasy Micro kit (50) | Qiagen | 74004 | Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used |
Agilent 2100 BioAnalyzer | Agilent Technologies | G2939A | |
Azure B Certified | MP Biomedicals | 190520 | Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity |
PBS | Sigma Life Science | D8537 | Any reliable source of RNase-free PBS |
RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water) | American Bioanalytical | AB04010-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase) | American Bioanalytical | AB02128-00500 | Any reliable source, can be lab-made |
RNase AWAY | Invitrogen Life Technologies | 10328-011 | Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used |
2-Methylbutane | Electron Microscopy Sciences | 78-78-4 | Any source |
Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips | Axygen | 311-03-051 & 311-09-051 | Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer's products before using |
O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryomold Intermediate Size | Tissue-Tek | 4566 | |
Lab wipes (Kimwipes) | KIMTECH | 34155 |