В этом видео мы демонстрируем протокол для вскрытия поперечной мышцы абдоминиса мыши и используем иммунофлуоресценцию и микроскопию для визуализации нервно-мышечных соединений.
Анализ нейромышечной морфологии соединения может дать важное представление о физиологическом состоянии данного моторного нейрона. Анализ тонких плоских мышц может предложить значительное преимущество по сравнению с традиционно используемыми более толстыми мышцами, такими как мышцы заднейконечности (например. гастрочнемиус). Тонкие мышцы позволяют всесторонне о обзоре всей иннервации данной мышцы, что, в свою очередь, позволяет идентифицировать выборочно уязвимые пулы моторных нейронов. Эти мышцы также позволяют анализ параметров, таких как размер моторного блока, аксональный ветвление, и терминал / нодаль прорастания. Общим препятствием в использовании таких мышц является получение технических знаний, чтобы вскрыть их. В этом видео мы подробно протокол для вскрытия поперечного abdominis (TVA) мышцы от молодых мышей и выполнения иммунофторесценции для визуализации аксонов и нервно-мышечных соединений (NMJs). Мы демонстрируем, что этот метод дает полный обзор иннервации картины мышцы TVA и может быть использован для исследования патологии NMJ в мышиной модели болезни моторных нейронов детства, спинальной мышечной атрофии.
Нейромышечные соединения (NMJs) являются синаптической связью между нижним моторным нейроном и скелетным мышечным волокном. Они традиционно считаются трехсторонней синапсе, состоит из нейрона (пресинаптического терминала), мышечного волокна (пост синаптический терминал) и терминальной ячейкиШванн 1. NMJs, как представляется, ранние и значительные цели в патологии в ряде заболеваний моторных нейронов и мышимодели 2,3. Типичными симптомами являются денервация, при которой двигательная эндплейт становится лишенной пресинаптической иннервации, отек пресинаптического терминала и снижение сложности морфологии NMJ4-11. Компенсационные ответы также могут быть отмечены, которые включают терминал и норд прорастания, где аксональные процессы простираются от оставшихся синаптических терминалов или интернодов до reinnervated denervated endplates12,13. Из-за жесткой корреляции между синаптической активностью и морфологией NMJ, можно получить много информации о функциональном состоянии моторных нейронов из анализа морфологии NMJ. Поскольку потеря NMJ часто представляет собой один из первых аспектовнервно-мышечной патологии 4,10, количественная оценка на уровне иннервации может дать важную информацию о прогрессировании патологии и потенциальном эффекте терапевтического вмешательства. Кроме того, поскольку потеря NMJ представляет собой значительный шаг в патологическом прогрессии, развитие терапевтических средств, которые могут стабилизировать связи и стимулировать регенерацию, может принести значительную пользу.
При анализе морфологии NMJ, выбор мышц имеет большое значение. Некоторые из основных соображений могут включать тип мышечного волокна, положение тела, и сравнительный анализ условий жизни человека. Кроме того, в тех случаях, когда требуются такие манипуляции, как инъекция веществ или травматическая травма нерва, важно также учитывать экспериментальную доступность. В целом, предпочтительнее анализировать диапазон мышц, расположенных по всему телу, отражающий ряд подтипов моторных единиц. Часто, однако, выбор мышц зависит от простоты вскрытия. Следовательно, анализ NMJ часто выполняется исключительно на больших аппендикулярных мышцах, таких как гастрокнеймиус. Для получения хорошего Окрашивания NMJ в таких мышцах часто требуется секционные или механические нарушения мышечных волокон. В результате, иннервация картина может стать нарушена и всеобъемлющий и высококачественный анализ иннервации моделей, прорастания и денервации часто скомпрометирована. Альтернативный подход заключается в использовании тонких плоских мышц, которые не требуют секции и могут быть окрашены и установлены нетронутыми, что позволяет всеобъемлющий обзор всей иннервации мышц. Есть ряд мышц, которые могут быть использованы для такого анализа, в том числе группа черепных мышц, (охватывающих леватор auris longus, auricularis выше, и аддуктор auris longus)14, грудные мышцы(например. триангуляции стерни) 15, и брюшной(например, поперечные abdominis (TVA)) мышцы. Основным препятствием в использовании таких мышц является техническая экспертиза, необходимая для вскрытия их без повреждений.
В этом видео, мы предоставляем протокол для вскрытия и выполнения иммунофлуоресцентной маркировки мышцы TVA от мыши, чтобы позволить всеобъемлющий анализ иннервации картины и морфологии NMJ. Мышцы TVA является преимущественно медленно дергаться мышцы, состоящие из глубочайшего слоя брюшной мускулатуры и innervated нижних межреберных нервов. Предыдущая работа показала, что он постоянно очень уязвим к патологии в ряде моделей мыши детства двигательной нейронной атрофии спинальной мышечной атрофии (SMA) и в других моделях мыши раннего начала двигательной дегенерациинейронов 4,16. Поэтому мы предлагаем, что TVA является полезной мышцей для проведения анализа NMJ в периферических невропатий.
В этом видео, у нас есть подробный протокол для вскрытия мышцы TVA от мыши и для всей установки иммунофторной маркировки NMJs в мышце. Мы также представляем данные, показывающие, что эта мышца может быть использована для анализа нервно-мышечной патологии соединения в мышиной модели SMA.
Успех в этом методе зависит от ряда факторов. Некоторые из наиболее распространенных проблем изложены ниже. Во-первых: плохое иммуногистохимическое окрашивание. Для этого может быть несколько причин, одной из наиболее распространенных из которых является использование различных реагентов к тем, которые перечислены в этом протоколе. Высокое качество электронной микроскопии класса PFA очень важно для обеспечения хорошего окрашивания, как и выбор антител, перечисленных в этом протоколе. Кроме того, у пожилых животных(т.е.> 3 месяца), получить хорошее качество окрашивания может быть сложнее. Это связано с увеличением толщины фасции, окружающей мышцу, и увеличением накопления жира между внешним косым и tranversus abdominis. Важно, чтобы сдирать жир, прежде чем приступить к иммунофлюоресценции. Это также может быть необходимо, чтобы сдирать некоторые фасции, покрывающей мышцы, которые могут стать утолщенными. Иногда трудно лишить фасции и жира из мышц, не понеся некоторые повреждения мышечного волокна и нарушения иннервации картины. Однако, если этот метод выполняется тщательно, хорошее качество окрашивания могут быть приобретены у мышей до по крайней мере 1 год. У более молодыхмышей (т.е.менее 3 месяцев) не должно быть необходимости выполнять какие-либо дразнить или разделения мышечных волокон. Во-вторых: трудно найти NMJs после вскрытия и окрашивания. Это часто потому, что вскрытие не распространяется под последним ребром. Большинство NMJs расположены чуть ниже последнего ребра и, следовательно, необходимо позаботиться, чтобы обеспечить эту часть мышцы включены в вскрытие. В-третьих: присоединение мышцы ЭО к мышце TVA. Это часто жалоба, когда люди пытаются продлить вскрытие ниже уровня внутренней косой (IO) мышцы. Область мышцы TVA, где io также присутствует, труднее анализировать, так как может быть трудно различить, какая мышца есть какая. По этой причине, мы обычно просто вскрыть наиболее превосходную часть мышцы TVA. На этом уровне, нет никакой приверженности между мышцами EO и TVA, и поэтому это не должно быть существенной проблемой.
Одним из значительных препятствий для использования мышцы TVA, по сравнению с аппендикулярными мышцами, является доступность для хирургических манипуляций или инъекций веществ. Эти типы экспериментов могут иметь решающее значение для исследования физиологии NMJ в данной мышце. Хотя TVA, безусловно, менее легко доступны, чем более часто используемые мышцы, такие как tibialis передней или gastrocnemius, предыдущая работа показала, что можно denervate TVA хирургическим повреждением межреберныхнервов 18. Недавно мы также использовали эту мышцу для местного администрирования веществ под общим наркозом (неопубликованные данные). Хотя эти эксперименты могут представлять собой умеренную техническую проблему, эта работа показывает, что они осуществимы и, таким образом, расширить полезность этой мышцы для анализа NMJs под патологических и физиологических манипуляций.
Мышцы TVA является одним из ряда тонких плоских мышц, расположенных по всему телу, которые могут быть использованы для цельно-монтажного анализа иннервации моделей. Другие мышцы включают в себя группу черепных мышц иннервированы двигательных нейронов, происходящих из лицевого ядра ствола мозга, охватывающих levator auris longus, auricularis начальник, и аддуктор auris longus, вскрытия, для которых былиописаны ранее 14,19. Кроме того, мускулатура окружающих мышцы TVA, в том числе EO, IO, и rectus abdominis, также могут быть помечены и использованы для анализа NMJ. Для всестороннего анализа патологии NMJ в модели мыши, важно рассмотреть ряд мышц, расположенных по всему телу и не ограничивать анализ одной мышцы. Это иллюстрируется в мышиных моделях заболеваний моторных нейронов, где существует значительная неоднородность в уровнях патологии NMJ между различными мышцами20. Такая межмышечная изменчивость является чрезвычайно ценным инструментом при исследовании механизма уязвимости моторных нейронов и, следовательно, ограничение анализа одной мышцы может значительно уменьшить потенциал исследования.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами от Канадских институтов исследований в области здравоохранения (грант номер MOP 38040) для Р.К., мышечной дистрофии ассоциации (США) для Р.К., семьи SMA в Р.К. и Л.M.M, SMA Trust к T.H.G., и мышечной дистрофии кампании T.H.G. Л.M.M является получателем Рассеянного склероза общества Канады постдокторской стипендии, и Р.К. является получателем университета здравоохранения научно-исследовательский кафедры из Университета Оттавы.
Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Angled Sprung Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | dependant on local supplier | Use this to make dissection dish for pinning out muscle |
Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
Coverslips | Fisher | ||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |