이 비디오에서 우리는 마우스의 트랜스 대 복부 근육의 해부에 대한 프로토콜을 시연하고 신경 근육 접합을 시각화하기 위해 면역 형광 및 현미경 검사를 사용합니다.
신경 근육 접합 형태학의 분석은 주어진 운동 신경의 생리 상태에 중요한 통찰력을 줄 수 있습니다. 얇은 평평한 근육의 분석은 일반적으로 뒷사지에서 와 같은 두꺼운 근육에 비해 상당한 이점을 제공 할 수 있습니다(예를 들어. 위장혈증). 얇은 근육은 주어진 근육에 대한 전체 내적 패턴의 포괄적 인 개요를 허용, 이는 차례로 모터 뉴런의 선택적으로 취약한 풀의 식별을 허용. 이 근육은 또한 모터 단위 크기, 축상 분기 및 말단/무달 발아와 같은 매개 변수의 분석을 허용합니다. 이러한 근육을 사용 하 여 일반적인 장애물 그들을 해부 하는 기술 전문 지식을 얻고 있다. 이 비디오에서는 젊은 쥐의 트랜스대 아도미니(TVA) 근육을 해부하고 축산및 신경근육 접합부(NMJs)를 시각화하기 위한 면역불광을 수행하는 프로토콜을 자세히 설명합니다. 우리는이 기술은 TVA 근육의 내면 패턴의 완전한 개요를 제공하고 어린 시절 운동 신경 질환, 척추 근육 위축의 마우스 모델에서 NMJ 병리학을 조사하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다.
신경 근육 접합부 (NMJs)는 낮은 운동 뉴런과 골격 근육 섬유 사이의 시냅스 연결입니다. 그들은 전통적으로 뉴런 (사전 시냅스 말기), 근육 섬유 (시냅스 후 말기), 및 말단 슈완 세포1로구성된 삼자 시냅스로 간주됩니다. NMJs는 모터 뉴런 질환 및 마우스 모델 의 범위에서 병리학에서 초기 및 중요한 표적으로 나타납니다2,3. 대표적인 증상으로는 모터 엔드플레이트가 사전 시냅스 이너밴션이 없는 데너밴션, 사전 시냅스 단자의 붓기, NMJ 형태4-11의복잡성 감소 등이 있다. 축전 공정이 남은 시냅스 단자 또는 인터노드에서 재입하 덴어바틱 엔드플레이트12,13으로확장되는 터미널 및 노달 발아를 포함하는 보상 응답도 주목할 수 있다. 시냅스 활동과 NMJ 형태 사이의 긴밀한 상관 관계로 인해 NMJ 형태 분석에서 모터 뉴런의 기능 적 상태에 대해 많은 정보를 얻을 수 있습니다. NMJs의 손실은 신경 근육 병리학의 첫 번째 측면 중 하나를 자주 나타내기 때문에4,10,내면의 수준에서 정량화는 병리학의 진행과 치료 개입의 잠재적 인 효과에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다. 더욱이, NMJ 손실은 병리학적 진행에 있는 중요한 단계를 나타내기 때문에, 연결을 안정시키고 재생을 격려할 수 있는 치료의 발달은 중요한 이득을 산출할 수 있습니다.
NMJ 형태를 분석 할 때, 근육 선택은 매우 중요합니다. 주요 고려 사항 중 일부는 근육 섬유 유형을 포함 할 수 있습니다,본문 위치, 인간의 조건에 비교 분석. 또한, 물질의 주입이나 외상성 신경 상해와 같은 조작이 필요한 경우 실험적 접근성도 고려해야 합니다. 일반적으로, 다양한 모터 유닛 아형을 반사하는 신체 전체에 위치되는 근육의 범위를 분석하는 것이 바람직하다. 종종, 그러나, 근육 선택은 해부의 용이성에 의해 영향을 받습니다. 따라서, NMJ 분석은 종종 위트로네미와같은 큰 부관 근육에 독점적으로 수행됩니다. 이러한 근육에 좋은 NMJ 염색을 얻으려면 근육 섬유의 단면 또는 기계적 중단이 종종 필요합니다. 그 결과, 내부 배양 패턴이 중단되고 내면패턴, 발아 및 기질에 대한 포괄적이고 고품질의 분석이 종종 손상될 수 있다. 다른 방법은 단면이 필요하지 않고 그대로 염색하고 장착 할 수있는 얇은 평평한 근육을 사용하는 것입니다, 근육의 전체 내부의 포괄적 인 개요를 허용. 이러한 분석에 사용할 수 있는 근육의 수가 있다, 두개골 근육의 그룹을 포함 하 여, (레 바 토르 오리스 롱온을포함 하 여, 유리 혈관 우수한,및 adductor auris longus)14,흉부 근육(예를 들어. 삼각형 흉골) 15,및 복부(예를 들어, 트랜스 대 abdominis (TVA)) 근육. 이러한 근육을 사용 하 여 주요 장애물은 손상 없이 그들을 해부 하는 데 필요한 기술 전문 지식.
이 비디오에서는 내발 패턴 및 NMJ 형태에 대한 포괄적 인 분석을 허용하기 위해 마우스에서 TVA 근육의 면역 형광 라벨링을 해부하고 수행하는 프로토콜을 제공합니다. TVA 근육은 주로 복부 근육의 가장 깊은 층을 포함하는 느린 트위치 근육이며 낮은 늑간 신경에 의해 내면화됩니다. 이전 연구는 유년기 운동 신경 질환 척추 근육 위축 (SMA)의 마우스 모델의 수와 초기 발병 운동 뉴런 변성의 다른 마우스 모델에서 병리학에 지속적으로 매우 취약한 것으로 나타났다4,16. 따라서 TVA는 말초 신경병증에서 NMJ 분석을 착수하기위한 유용한 근육이라고 제안합니다.
이 비디오에서는 마우스에서 TVA 근육의 해부와 근육 내의 NMJ의 전체 마운트 면역 형광 라벨링에 대한 프로토콜을 자세히 설명했습니다. 우리는 또한 이 근이 SMA의 마우스 모형에 있는 신경 근육 접합 병리를 분석하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여주는 데이터를 제시합니다.
이 기술의 성공은 여러 가지 요인에 의존합니다. 가장 일반적인 문제 중 일부는 아래에 설명되어 있습니다. 첫째: 면역 성화학 염색 불량. 이 프로토콜에 나열된 시약에 대해 다른 시약을 사용하는 가장 일반적인 이유 중 하나가 있을 수 있습니다. 고품질 전자 현미경 등급 PFA는 이 프로토콜에 나열된 항체의 선택과 마찬가지로 좋은 염색을 보장하는 것이 매우 중요합니다. 또한, 오래된동물(즉,3개월 >)에서는 양질의 염색이 더 어려울 수 있습니다. 이것은 근육을 둘러싼 근막의 증가 두께와 외부 경사와 횡포 복부 사이의 지방 축적의 증가 때문입니다. 면역 형광을 진행하기 전에 지방을 제거하는 것이 중요합니다. 그것은 또한 근육을 덮고 근 막의 일부를 제거 해야 할 수 있습니다., 두껍게 될 수 있는. 근육 섬유에 약간의 손상과 내면 패턴에 장애를 발생하지 않고 근육에서 근막과 지방을 제거하는 것은 때때로 어렵습니다. 그러나 이 기술이 신중하게 수행되는 경우, 좋은 품질의 염색은 적어도 1 세까지 마우스에서 취득 할 수 있습니다. 젊은 마우스(즉,3 개월 미만)에서 근육 섬유의 놀리거나 분리를 수행 할 필요가 없습니다. 둘째: 해부와 염색에 따라 NMJ를 찾기가 어렵습니다. 이것은 종종 해부가 마지막 갈비뼈 아래에 확장되지 않았기 때문입니다. NMJs의 대부분은 마지막 갈비뼈 바로 아래에 위치하고 있으므로 근육의이 부분이 해부에 포함되도록주의를 기울여야합니다. 셋째: TVA 근육에 EO 근육의 준수. 이것은 종종 개인이 내부 경사 (IO) 근육의 수준 이하로 해부를 확장하려고 할 때 불만입니다. IO가 존재하는 TVA 근육의 영역은 어떤 근육을 구별하기 어려울 수 있으므로 분석하기가 더 어렵습니다. 이러한 이유로, 우리는 정기적으로 그냥 TVA 근육의 가장 우수한 부분을 해부. 이 수준에서, EO와 TVA 근육 사이 아무 준수, 따라서이 중요 한 문제가 되지 않아야.
TVA 근육을 사용 하 여 한 가지 중요 한 장애물, 부 동 근육에 비해, 외과 조작 또는 물질의 주입에 대 한 접근성. 실험의 이 모형은 주어진 근육에 있는 NMJ 생리학을 조사하기 위하여 중요할 수 있습니다. TVA는 확실히 덜 쉽게 티비알리스 전방 또는 위장혈증과같은 일반적으로 사용되는 근육보다 접근이 덜 하지만, 이전 작품은 늑간 신경의 외과 적 부상으로 TVA를 데너베이트 할 수 있음을 보여 주었다18. 우리는 최근에 또한 일반적인 마취제 (미공개 데이터)에 따라 물질의 지방 관리를 위해이 근육을 사용했습니다. 이러한 실험은 온건한 기술적 도전을 나타낼 수 있더라도, 이 작품은 그(것)들이 실현 가능하다는 것을 보여주고 따라서 병리학및 생리적인 조작에서 NMJ의 분석을 위한 이 근육의 유용성을 확장합니다.
TVA 근육은 내부 변기 패턴의 전체 마운트 분석에 사용할 수있는 몸 전체에 위치한 얇은 평평한 근육의 숫자 중 하나입니다. 그밖 근육은 뇌줄기의 안면 핵에서 유래한 운동 신경에 의해 안쪽으로 부적절근육의 단을 포함하고, 레바토르 오리스 롱우스, 그리고 aurior auris longus,이전에 설명된 해부14,19를포함한다. 또한 EO, IO, 직류 아보미니등 TVA 근육을 둘러싼 근육도 NMJ 분석에 표시되고 사용될 수 있다. 마우스 모형에 있는 NMJ 병리학의 포괄적인 분석을 위해, 바디를 통해 위치한 근육의 수를 고려하고 단 하나 근육으로 분석을 제한하지 않는 것이 중요합니다. 이것은 다른근육(20)사이의 NMJ 병리학 수준에서 중요한 이질성이 있는 운동 신경 질환의 마우스 모델에서 예시된다. 이러한 근육 간 가변성은 운동 신경 취약성의 메커니즘을 조사할 때 매우 귀중한 도구이므로 단일 근육으로 분석을 제한하면 연구의 잠재력을 크게 감소시킬 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 캐나다 보건 연구소 (교부금 MOP 38040)에서 R.K.에 대한 보조금, R.K.에 대한 근이영양증 협회 (미국), R.K.와 L.M.M SMA 가족, T.H.G.에 대한 SMA 신탁 및 T.H.G.에 대한 근육 이영양증 캠페인에 의해 지원되었습니다. L.M.M 캐나다 박사 후 펠로우십의 다발성 경화증 학회의 수혜자이며, R.K.는 오타와 대학에서 대학 건강 연구 위원장의 수령인입니다.
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