Mini-Invasiva Istituzione di murini ortotopico vescica Xenotrapianti
Summary
La tecnica istituita per inoculare ortotopici xenotrapianti carcinoma vescicale invasivo primarie richiede laparotomia e la mobilitazione della vescica. Questa procedura infligge significativa morbilità sui topi, è tecnicamente difficile e richiede molto tempo. Abbiamo quindi sviluppato una alta precisione, approccio percutaneo utilizzando guida ecografica.
Abstract
Ortotopici xenotrapianti cancro della vescica sono il gold standard per lo studio manipolazioni cellulari molecolari e di nuovi agenti terapeutici in vivo. Le linee cellulari adeguate sono inoculate mediante instillazione intravescicale (modello di crescita invasiva non muscolari) o iniezione intramurale nella parete vescicale (modello di crescita invasiva). Entrambe le procedure sono complesse e molto tempo. Inoltre, il modello superficiale ha i suoi difetti dovuti alla mancanza di linee cellulari che sono oncogeno seguente instillazione. Iniezione intramurale, d'altra parte, è viziata da l'invasività della procedura e la morbilità associata per il mouse ospitante.
Con queste carenze in mente, abbiamo modificato i metodi precedenti per sviluppare un approccio mini-invasivo per la creazione di ortotopici xenotrapianti cancro della vescica. Utilizzando guida ecografica abbiamo svolto con successo l'inoculazione percutanea delle linee di cellule di cancro alla vescica UM-UC1, UM-UC3 e UM-UC13 in 50 nude atimico. Siamo stati in grado di dimostrare che questo approccio è tempo efficiente, preciso e sicuro. Con questa tecnica, inizialmente uno spazio viene realizzato sotto la mucosa vescicale con PBS, e le cellule tumorali sono poi iniettato in questo spazio in una seconda fase. La crescita del tumore è monitorata ad intervalli regolari con bioluminescenza e gli ultrasuoni. I volumi medi di tumore sono aumentati costantemente in in tutti, ma uno dei nostri 50 topi durante il periodo di studio.
Nel nostro istituto, questo nuovo approccio, che permette di xenotrapianto cancro alla vescica inoculazione in modo minimamente invasivo, rapido ed estremamente preciso, ha sostituito il modello tradizionale.
Introduction
La ricerca sul cancro dipende da modelli animali di cancro umano utilizzando linee cellulari derivate da tumori di pazienti, al fine di approfondire la nostra comprensione della biologia del tumore. Per l'analisi in vivo crescita sotto strategie di trattamento diversi modelli murini ortotopici cancro della vescica rimane lo standard di riferimento 1,2. L'inoculazione delle cellule tumorali della vescica umane in topi immunocompromessi (modello di xenotrapianto) si basa sulla instillazione intravescicale ("modello intravesical") 3,4,5 o iniezione diretta nella parete vescicale ("modello intramoenia") 6,7. Entrambe le tecniche possono essere condotti in ratti 8,9.
Instillazione intravescicale induce la formazione di tumori sulla superficie uroteliale della vescica che poi sono suscettibili di successiva instillazione intravescicale di agenti terapeutici innovativi. Tuttavia, il numero di linee cellulari che sono attendibilmente oncogeno quando distribuito mediante questo metodo è limitato und una di queste linee cellulari, KU7, è stato recentemente dimostrato di essere HeLa 4,10. Instillazione intravescicale è anche molto tempo a causa di tempi di sosta necessarie, e induce frequentemente la crescita tumorale in elementi adiacenti del tratto urinario, incluse uretra, uretere e pelvi renale 11. Inoltre, l'instillazione intravescicale spesso porta alla crescita del tumore sul pavimento della vescica in cui gli ureteri entrano nella vescica, e questo può causare ostruzione del tratto superiore ed insufficienza renale concomitante.
Xenotrapianti primarie carcinoma vescicale invasivo che sono adatti per trattamenti sistemici sono creati mediante iniezione diretta di cellule tumorali nella parete della vescica 12. Sebbene numerose linee cellulari crescono adeguatamente in questo modello, la sua limitazione è l'invasività del modello relativo alla necessità di un'incisione addominale 13. Il modello è anche difficile da imparare a causa della difficoltà tecnica di iniezione di cellule precisamente nella parete muscolaredella vescica.
Un nuovo approccio per stabilire ortotopici xenotrapianti tumorali della vescica invasivo primarie nei topi è stato sviluppato nel nostro reparto, al fine di affrontare le carenze esistenti del "modello intramurale". Siamo stati in grado di ottimizzare l'iniezione percutanea eco-guidata delle cellule tumorali della vescica nella parete vescicale anteriore, con conseguente questa nuova tecnica per sostituire con successo il modello invasiva stabilita. Inoltre abbiamo potenzialmente migliorato l'accuratezza e la riproducibilità del "modello intramurale".
Protocol
Representative Results
Discussion
Quasi tutti i grandi progressi nella terapia del cancro richiedono test su modelli animali prima di iniziare le sperimentazioni cliniche. Modelli animali di cancro sono strumenti essenziali che permettono ai ricercatori di studiare la biologia del tumore in vivo. Modelli di xenotrapianto ortotopico rimangono l'oro standard di 1,2 e continuano ad offrire la massima flessibilità (in termini di selezione delle linee di cellule) e hanno l'utility più pratico.
La procedura illustrata è una modifica minimamente invasiva del modello ortotopico precedentemente descritto da Dinney et al. 12 Abbiamo stabilito tumori xenotrapianto da ecoguidato iniezione percutanea di tre linee cellulari differenti con un tasso di successo tecnico del 100%. Durante continuo follow-up, il 98% dei topi ha dimostrato costante aumento del volume del tumore.
Eseguendo una tecnica minimamente invasiva siamo stati in grado di affrontare i limiti attuali del modello intramurale. Oltre respeamen benessere degli animali, l'invasività ridotta di questo procedimento contribuisce anche alla riproducibilità di esperimenti in vivo diminuendo il numero di complicazioni chirurgiche. E 'molto tempo efficace per evitare una laparotomia addominale e conseguente necessità per la chiusura della ferita. Siamo riusciti a ridurre significativamente il tempo di procedura per animale a 3,4 min (± 1.6). Tuttavia, il vantaggio principale del nostro nuovo approccio è la sua precisione. Ad alta risoluzione ultrasuoni ci permette di visualizzare lo spazio creato da iniezione salina sotto la mucosa della parete della vescica. Questa prima iniezione passo facilita l'iniezione delle cellule tumorali in una seconda fase e minimizza il rischio di fuoriuscita delle cellule tumorali. Ciò contrasta con la tecnica di iniezione intramurale dopo laparotomia, dove è impossibile visualizzare posizionamento dell'ago e c'è sempre un elemento di incertezza circa l'esatta profondità di iniezione. Inoltre, come stiamo inoculando cellule tumorali rigorosamente nella parete vescicale anteriore, growt tumoreh sulla parete posteriore della vescica è evitata. Successivamente il tasso di complicanze ostruttive causa della crescita del tumore in prossimità degli orifizi ureterali è estremamente raro. Questo effetto di accompagnamento consente periodi di crescita e di trattamento più lunghi.
La limitazione principale del tumore inoculazione ecografico è la necessità di misure tecniche adeguate. Pertanto le prestazioni di questa procedura sarà probabilmente limitata ai centri che sono specializzati in modelli animali di cancro umano. Ciò dovrebbe incoraggiare le collaborazioni tra gruppi di ricerca al di fuori di queste istituzioni e dei gruppi con competenze in tale modellizzazione animali romanzo.
Anche se dipende dalla familiarità con ecografia e una certa destrezza manuale, questo modello è facile da imparare sotto istruzione competente. Il passaggio chiave nella procedura è la creazione di un sottomucosa spazio artificiale nella parete della vescica con soluzione fisiologica. Una volta che questo spazio è creato senza perforazione of strato mucoso, rimane stabile per diversi minuti. La guida del secondo ago in questo spazio per inoculare le cellule tumorali è relativamente semplice. La complicazione principale durante la creazione dello spazio sottomucosa è perforazione dell'ago nel lume della vescica. La creazione di uno spazio sottomucosa, tuttavia, rimane fattibile. L'ago deve essere ritirato lentamente nella parete della vescica e la soluzione salina iniettata solo quando lo strato mucoso ribalta la punta dell'ago. Dopo questa manovra spazio sottomucosa è meno stabile (soluzione fisiologica fluisca al lume vescicale entro 30-60 sec) e l'iniezione delle cellule tumorali deve essere eseguita rapidamente. Fuoriuscita di cellule tumorali nel lume della vescica può verificarsi in questi casi con perforazione della mucosa. Anche se la perdita di cellule tumorali dallo spazio intramurale potrebbe portare a un volume del tumore è diminuito durante il follow-up, non abbiamo mai osservato alcun assorbimento del tumore intravesical.
Un altro potenziale complication è la fuoriuscita di cellule tumorali nella cavità peritoneale attraverso il canale di iniezione. Abbiamo osservato una sola intraperitoneale disseminazione tumorale delle cellule in 50 animali, e questo si è verificato in uno dei nostri primi tentativi. Noi attribuiamo questo l'iniezione di un volume eccessivo sospensione di cellule tumorali. Ciò è stato confermato dal fatto che la riduzione del volume di 50-40 ml non ha comportato ulteriori spargimenti intraperitoneale.
Questo inoculazione minimamente invasiva murino ortotopico xenotrapianto cancro della vescica rappresenta una modifica innovativa del "modello intramurale" esistenti, beneficiando sia l'investigatore e gli animali allo stesso modo. I vantaggi di questo modello incoraggiare il suo adattamento ad altri organi come il rene, prostata e fegato per stabilire tumori xenotrapianto ortotopiche in modo minimamente invasivo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Eliana Beraldi per l'esecuzione di trasduzione virale di linee cellulari tumorali e Ben Deeley per la sua istruzione sull'uso della piccola piattaforma ecografica animale.
Questo progetto è stato sostenuto dalla Fondazione Sistema tedesco (DFG, JA 2117/1-1: 1), il Research Institute Canadian Cancer Society e Mentored medico Scientist Award da Vancouver Coastal Health Research Institute. La piattaforma di imaging ad ultrasuoni è stato finanziato dalla Fondazione canadese per l'innovazione.
Materials
| Chlorhexidine gluconate (2%) | Aplicare | 82-319 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3008101 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 356234 | Keep between 2-4⁰C |
| Isoflurane | Baxter Corporation | 402-069-02 | |
| Trypsin (0.25%) | Thermo Scientific | SH3004202 | |
| Syringe (1ml) | BD Bioscience | 309659 | |
| Hypodermic needle (30G; ¾ inch) | Kendall | 830340 | |
| Angiocatheter (24G) | BD Bioscience | 381112 | |
| Vevo 770 small animal imaging platform | VisualSonics | ||
| RMV 706 ultrasound scanhead | VisualSonics | ||
| IVIS Lumina III | Caliper Life Science |
References
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