Минимально инвазивная Создание мышиной артифициального мочевого пузыря ксенотрансплантатов
Summary
Установленная техника привить первичные инвазивных Ортотопическая ксенотрансплантаты рак мочевого пузыря требуется лапаротомия и мобилизации мочевого пузыря. Эта процедура наносит значительную заболеваемость на мышах, технически сложным и трудоемким. Поэтому мы разработали высокоточную, чрескожная подход с использованием ультразвукового контроля.
Abstract
Ортотопическая ксенотрансплантаты рака мочевого пузыря являются золотым стандартом для изучения молекулярных клеточных манипуляций и новых терапевтических средств в естественных условиях. Подходящие клеточные линии прививку либо внутрипузырного введения (модель немышечно инвазивного роста) или очной инъекции в стенку мочевого пузыря (модель инвазивного роста). Обе процедуры являются сложными и очень много времени. Кроме того, поверхностное модель имеет свои недостатки из-за отсутствия клеточных линий, которые онкогенными следующее внушение. Внутренние инъекции, с другой стороны, омрачен инвазивности процедуры и связанной с ним заболеваемости для принимающей мыши.
С помощью этих недостатков в виду, мы изменили предыдущие методы разработать минимально инвазивной подход к созданию Ортотопическая ксенотрансплантаты рака мочевого пузыря. Использование ультразвукового контроля мы успешно выполняется чрескожное прививку от рака мочевого пузыря клеточных линий УМ-uc1, УМ-UC3 и УМ-UC13 в 50 бестимусных голых. Нам удалось показать, что этот подход является время эффективным, точным и безопасным. С помощью этого метода, первоначально пространство создается под слизистой оболочки мочевого пузыря с PBS, и опухолевые клетки затем вводят в этом пространстве на второй стадии. Рост опухоли контролируется на регулярной основе с биолюминесценции томография и ультразвук. Средние объемы опухолей постоянно увеличивается в во всех, кроме одного из наших 50 мышей за период исследования.
В нашем институте, это новый подход, который позволяет рак мочевого пузыря ксенотрансплантата прививку в минимально-инвазивной, быстрого и очень точный способ, заменил традиционную модель.
Introduction
Исследования рака зависит от животных моделях рака у человека с использованием линий клеток, полученных из опухолей пациентов для того, чтобы углубить наше понимание биологии опухоли. Для в естественных условиях анализа роста при различных стратегий лечения мышиный Ортотопическая модели рака мочевого пузыря остается эталон 1,2. Прививка человеческих раковых клеток мочевого пузыря с ослабленным иммунитетом мышей (ксенотрансплантат модель) опирается на внутрипузырного введения ("внутрипузырную модель") 3,4,5 или прямой инъекции в стенке мочевого пузыря ("очный модели") 6,7. Оба метода также может быть выполнена на крысах 8,9.
Внутрипузырного введения индуцирует образование опухолей на уротелиальной поверхности мочевого пузыря, который затем поддаются последующей внутрипузырного введения новых препаратов лечения. Тем не менее, количество клеточных линий, которые надежно онкогенными при доставке через этот метод ограниченг один из тех клеточных линий, KU7, недавно было показано, что клетки HeLa 4,10. Внутрипузырного введения также отнимает много времени из-за необходимых временами удержания, и это часто вызывает рост опухоли в смежных элементов мочевыводящих путей, в том числе уретры, мочеточника и почечной лоханки 11. Кроме того, внутрипузырного введения часто приводит к росту опухоли на полу мочевого пузыря, где мочеточники войти в мочевой пузырь, и это может привести к обструкции верхних тракта и сопутствующей почечной недостаточности.
Первичные инвазивные ксенотрансплантатов рака мочевого пузыря, которые пригодны для лечения системных создаются путем прямой инъекции опухолевых клеток в стенке мочевого пузыря 12. Несмотря на многочисленные клеточные линии расти адекватно в этой модели, ее ограничением является насильственный характер модели, связанной с необходимостью брюшной разрез 13. Модель также вызов, чтобы узнать из-за технических трудностей инъекционных клетки именно в мышечную стенкумочевого пузыря.
Новый подход для установления Ортотопическая первичные инвазивных ксенотрансплантаты рака мочевого пузыря у мышей была разработана в нашем отделе в целях устранения существующих недостатков "очной модели". Мы смогли оптимизировать чрескожное, под ультразвуковым контролем инъекции раковых клеток мочевого пузыря в переднюю стенку мочевого пузыря, что приводит к этой новой техники, чтобы успешно заменить установленную инвазивной модель. Кроме того, мы потенциально повысило точность и воспроизводимость "очной модели".
Protocol
Representative Results
Discussion
Практически все крупные достижения в области терапии рака потребует тестирования на животных моделях до начала клинических испытаний. Животных моделях рака являются важными инструментами, которые позволяют исследователям изучать биологию опухоли в естественных условиях. Ортотопическая ксенотрансплантата модели остаются золотым стандартом 1,2 и продолжать предлагать наибольшую гибкость (в плане отбора клеточных линий) и имеют наиболее практическую ценность.
Иллюстрированное процедура является минимально инвазивной модификация ортотопической модели, описанной ранее Dinney др.. 12 Мы установленном ксенотрансплантатов опухолей с помощью ультразвукового руководствоваться чрескожной инъекции трех различных клеточных линий с технической вероятностью успеха 100%. Во время непрерывной последующей деятельности, 98% мышей продемонстрировали постоянное увеличение объема опухоли.
Выполняя минимально-инвазивной техники мы смогли решить существующие ограничения очной модели. Кроме respecting благополучия животных, снижается травматичность этой процедуры также способствует воспроизводимости естественных условиях экспериментов в счет уменьшения количества хирургических осложнений. Весьма эффективны раз, чтобы избежать брюшной лапаротомии и связанного необходимость закрытия раны. Мы смогли значительно уменьшить время процедуры на одно животное до 3,4 мин (± 1,6). Тем не менее, основное преимущество нашей нового подхода является его точность. Высокое разрешение УЗИ позволяет визуализировать пространство, созданное инъекции физиологического раствора под слизистую оболочку стенки мочевого пузыря. Этот первый шаг впрыска облегчает инъекции опухолевых клеток на второй стадии и сводит к минимуму риск утечки опухолевых клеток. Это контрастирует с техникой очной инъекции после лапаротомии, где невозможно визуализировать размещение иглы и всегда есть элемент неопределенности относительно точной глубины инъекции. Кроме того, как мы прививки опухолевых клеток строго в переднюю стенку мочевого пузыря, опухоли growtч на стене задней мочевого пузыря избежать. Впоследствии скорость обструктивных осложнений опухолевого роста в близости от мочеточника отверстий крайне редко. Это сопровождающее эффект позволяет более длительные периоды роста и лечения.
Основным ограничением ультразвуковой наведением прививки опухоли является необходимость адекватного технического оборудования. Поэтому производительность этой процедуры, вероятно, будет ограничен центров, которые специализируются на животных моделях рака у человека. Это должно стимулировать сотрудничество между исследовательскими группами за пределами этих учреждений и групп, имеющих опыт в этих новых моделей животных.
Хотя зависит от знакомства с ультразвуковой визуализации и некоторые ловкость рук, эта модель легко узнать под компетентным обучения. Ключевым шагом в процедуре является создание искусственного космического подслизистый слой стенки мочевого пузыря с физиологическим раствором. Как только это пространство создается без перфорации Oе слоя слизистой оболочки, он остается стабильным в течение нескольких минут. Руководством второй иглы в этом пространстве, с тем чтобы инокуляции опухолевых клеток является относительно простым. Основная сложность при создании подслизистом пространстве перфорация иглой в просвет мочевого пузыря. Создание подслизистой пространства, однако, остается возможным. Игла должна быть снята медленно в стенке мочевого пузыря и физиологический раствор вводили только, когда слой слизистой переворачивает кончика иглы. После этого маневра подслизистой пространство является менее стабильным (физиологический раствор избежит в просвете мочевого пузыря в течение 30-60 сек) и инъекции опухолевых клеток должна быть выполнена быстро. При попадании опухолевых клеток в полость мочевого пузыря может происходить в этих случаях с перфорацией слизистой оболочки. Хотя потери опухолевых клеток от очной пространстве может привести к снижению объема опухоли во время наблюдения, мы никогда не наблюдали никаких внутрипузырную поглощение опухоли.
Еще одна потенциальная сomplication является утечка опухолевых клеток в брюшную полость через канал инъекции. Мы наблюдали только один внутрибрюшинную распространение опухолевых клеток в 50 животных, и это произошло в одном из наших первых попыток. Мы связываем это с инъекцией слишком большой объем опухолевых клеток подвески. Об этом свидетельствует тот факт, что уменьшение объема от 50-40 мкл в результате без дальнейшего внутрибрюшинного утечки.
Это минимально инвазивная прививка мышиного ортотопического ксенотрансплантате рака мочевого пузыря представляет собой инновационную модификацию существующего "очной модели", извлечение преимуществ как следователь и животных одинаково. Преимущества этой модели стимулировать его адаптацию к других органах, таких как почки, простаты и печени в целях установления ортотопической опухолей ксенотрансплантатов в минимально-инвазивным способом.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность Eliana Beraldi для выполнения вирусной трансдукции клеточных линий опухолевых и Бен Дили для его поручению на использование небольшого животного платформы ультразвукового изображения.
Этот проект был поддержан системе немецкого Фонда (DFG; JA 2117/1-1: 1), Научно-исследовательский институт Канадского общества рака и наставником Врач Ученый Награда от Ванкувера прибрежной научно-исследовательского института здравоохранения. Платформа ультразвуковое исследование финансировалось Канадского фонда инноваций.
Materials
| Chlorhexidine gluconate (2%) | Aplicare | 82-319 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3008101 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 356234 | Keep between 2-4⁰C |
| Isoflurane | Baxter Corporation | 402-069-02 | |
| Trypsin (0.25%) | Thermo Scientific | SH3004202 | |
| Syringe (1ml) | BD Bioscience | 309659 | |
| Hypodermic needle (30G; ¾ inch) | Kendall | 830340 | |
| Angiocatheter (24G) | BD Bioscience | 381112 | |
| Vevo 770 small animal imaging platform | VisualSonics | ||
| RMV 706 ultrasound scanhead | VisualSonics | ||
| IVIS Lumina III | Caliper Life Science |
References
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J. Cell. Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU Int. 100, 1377-1384 (2007).
- Kang, M. R., et al. An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Xiao, Z., et al. Characterization of a novel transplantable orthotopic rat bladder transitional cell tumour model. Br. J. Cancer. 81, 638-646 (1999).
- Iinuma, S., Bachor, R., Flotte, T., Hasan, T. Biodistribution and phototoxicity of 5-aminolevulinic acid-induced PpIX in an orthotopic rat bladder tumor model. J. Urol. 153, 802-806 (1995).
- Jäger, W., et al. Hiding in plain view: Genetic profiling reveals decades old cross-contamination of bladder cancer cell line KU7 with HeLa. J. Urol. (13), (2013).
- Horiguchi, Y., Larchian, W. A., Kaplinsky, R., Fair, W. R., Heston, W. D. Intravesical liposome-mediated interleukin-2 gene therapy in orthotopic murine bladder cancer model. Gene Ther. 7, 844-851 (2000).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Black, P. C., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106, 1799-1804 (2010).
