פולשנית הקמת Murine Orthotopic שלפוחית השתן xenografts
Summary
הטכניקה המבוססת לחסן xenografts orthotopic פולשנית העיקרית לסרטן שלפוחית השתן דורשת laparotomy והתגייסות של שלפוחית השתן. הליך זה גורם תחלואה משמעותית בעכברים, הוא מאתגר מבחינה טכנית ודורש זמן רב. לפיכך, אנו פיתחנו דיוק גבוה, בגישה מלעורית ניצול הנחיית אולטרסאונד.
Abstract
xenografts סרטן שלפוחית השתן Orthotopic הן סטנדרטי ללמוד מניפולציות מולקולריות תאיות וסוכנים טיפוליים חדשים בvivo זהב. שורות תאים מתאימות מחוסנות או על ידי החדרת שלפוחית (מודל של צמיחה פולשנית nonmuscle) או הזרקת ביצוע עצמית לתוך קיר שלפוחית השתן (מודל של צמיחה פולשנית). שני ההליכים מורכבים ומאוד זמן רב. בנוסף, יש לו את המודל השטחי חסרונותיו בשל החוסר של שורות תאים, כי הם החדרה הבאה tumorigenic. הזרקת ביצוע עצמי, ומצד שני, הוא נפגמה על ידי הפולשנות של ההליך והתחלואה הקשורים לעכבר המחשב המארח.
עם החסרונות האלה בחשבון, שינינו שיטות קודמות לפתח גישה פולשנית ליצירת xenografts סרטן שלפוחית השתן orthotopic. באמצעות הדרכת אולטרסאונד יש לנו לבצע חיסון מלעורית של שורות תאי סרטן שלפוחית השתן UM-UC1, UM-UC3 וUM-בהצלחהUC13 ל50 עירום athymic. אנחנו כבר הצלחנו להוכיח כי גישה זו היא זמן יעיל, מדויק ובטוח. בעזרת טכניקה זו, תחילה נוצר מרחב מתחת לרירית שלפוחית השתן עם PBS, ולאחר מכן תאים סרטניים מוזרקים לתוך החלל הזה בשלב שני. צמיחת גידול מנוטרת במרווחי זמן קבועים עם הדמיה פליטת אור ואולטרסאונד. כרכי הגידול הממוצע גדלו בהתמדה בכל אבל אחד 50 העכברים שלנו לאורך תקופת המחקר.
במוסד שלנו, זו גישה חדשנית, המאפשרת חיסון xenograft סרטן שלפוחית השתן באופן מינימאלי פולשנית, מהיר ומדויק ביותר, החליפה את המודל המסורתי.
Introduction
מחקר הסרטן תלוי במודלים של בעלי חיים של סרטן אנושי באמצעות שורות תאים שמקורם בגידולי מטופל על מנת להעמיק את ההבנה של ביולוגיה של גידול שלנו. לin vivo ניתוח צמיחה באסטרטגיות שונות לטיפול בסרטן שלפוחית השתן מודלים העכברי orthotopic יישארו סטנדרטי 1,2 ההתייחסות. החיסון של תאי סרטן שלפוחית השתן אנושיים בעכברי מדוכאי חיסון (מודל xenograft) מסתמך על החדרת שלפוחית ("מודל שלפוחית") 3,4,5 או הזרקה ישירה לתוך קיר שלפוחית השתן ("מודל בין חומות") 6,7. יכולות גם להתבצע בשתי טכניקות בחולדות 8,9.
החדרת שלפוחית גורמת להיווצרות של גידולים על פני urothelial של שלפוחית השתן אשר לאחר מכן ניתנים להחדרת שלפוחית הבאה של סוכני טיפול חדשניים. עם זאת, מספר שורות תאים אשר באופן מהימן tumorigenic כאשר מועברים באמצעות שיטה זו מוגבלד אחד של שורות תאים אלה, KU7, לאחרונה הוכח להיות הלה 4,10. החדרת שלפוחית היא גם זמן רב בשל צורך להתעכב פעמים, וזה לעתים קרובות גורם לצמיחת גידולים באלמנטים הסמוכים של דרכי השתן, כולל שופכה, שופכן, ואגן הכליה 11. יתר על כן, החדרת שלפוחית לעתים קרובות מובילה לצמיחה של גידול על רצפת השלפוחית בי השופכנים להיכנס לשלפוחית השתן, וזה יכול לגרום לחסימה בדרכי עליונה ואי ספיקת כליות במקביל.
xenografts סרטן שלפוחית השתן פולשנית העיקרית אשר מתאימות לטיפולים מערכתיים נוצרות על ידי הזרקה ישירה של תאי גידול לדופן שלפוחית 12. למרות ששורות תאים רבות לגדול כראוי במודל זה, הגבלתה היא הפולשנות של המודל הנוגע לצורך בחתך בבטן 13. המודל הוא גם מאתגר ללמוד בשל הקושי הטכני של הזרקת תאים בדיוק לקיר השרירשל שלפוחית השתן.
גישה חדשנית להקמת xenografts פולשנית העיקרית orthotopic סרטן שלפוחית השתן בעכברים פותחה במחלקה שלנו על מנת לטפל בליקויים קיימים של "המודל בין החומות". הצלחנו לייעל את ההזרקה של תאי סרטן שלפוחית השתן מלעורית, אולטרסאונד מונחה לדופן השלפוחית הקדמי וכתוצאה מכך טכניקה חדשנית זו כדי להחליף את המודל פולשנית הוקם בהצלחה. יתר על כן יש לנו פוטנציאל משופר הדיוק ושחזור של "המודל בין החומות".
Protocol
Representative Results
Discussion
כמעט כל התקדמות גדולה בטיפול בסרטן תדרוש בדיקות במודלים של בעלי חיים לפני ביצוע ניסויים קליניים. מודלים של בעלי החיים של הסרטן הם כלים חיוניים המאפשרים לחוקרים ללמוד ביולוגיה גידול in vivo. המודלים xenograft Orthotopic יישארו הזהב סטנדרטי 1,2 וימשיכו להציע את הגמישות ביותר (במונחים של בחירה של שורות תאים) ויש להם את הכלי הכי הפרקטי.
ההליך המאויר הוא שינוי פולשנית של מודל orthotopic תואר בעבר על ידי Dinney et al. 12 הקמנו גידולי xenograft בזריקה מלעורית אולטרסאונד המודרך של שלוש שורות תאים שונות עם שיעור הצלחה טכני של 100%. במהלך תקופת המעקב רציף, 98% מעכברים הראו עלייה מתמדת בנפח גידול.
על ידי ביצוע טכניקה מינימאלית פולשנית היינו יכול לטפל במגבלות קיימות של מודל החומות. חוץ מrespecting רווחת בעלי חיים, הפולשנות מופחתת של הליך זה גם תורמת לשחזור של ניסויי in vivo על ידי הפחתת מספר הסיבוכים ניתוחיים. זה מאוד זמן יעיל, כדי למנוע laparotomy בטן וצורך הקשורים לסגירת פצעים. היינו יכול להקטין באופן משמעותי את זמן הליך לכל בעל חיים ל3.4 דקות (± 1.6). עם זאת, היתרון העיקרי של הגישה החדשנית שלנו הוא הדיוק שלה. אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה מאפשר לנו לדמיין את החלל שנוצר על ידי הזרקה מי מלח מתחת לרירית של דופן השלפוחית. הזרקת הצעד ראשונה זה מקלה על הזרקת תאים סרטניים בשלב שני וממזערת את הסיכון של דליפה של תאים הסרטניים. זאת בניגוד לטכניקה של הזרקת ביצוע עצמית לאחר פיום בטן, שבו אי אפשר לדמיין מיקום מחט ותמיד יש אלמנט של חוסר ודאות לגבי עומק ההזרקה המדויק. כמו כן,, growt גידול כפי שאנו inoculating תאים סרטניים אך ורק לדופן השלפוחית הקדמישעות על קיר שלפוחית השתן האחורי הוא התחמק. כתוצאה מכך שיעור סיבוכים חסימתית בשל צמיחת גידול בקרבה של הפתחים בשופכן הוא נדיר ביותר. אפקט נלווה זה מאפשר תקופות גידול וטיפול ארוכות יותר.
המגבלה העיקרית של חיסון גידול אולטרסאונד מונחה היא הצורך בציוד טכני מתאים. לכן הביצועים של הליך זה צפוי להיות מוגבל למרכזים המתמחים במודלים של בעלי חיים של סרטן אנושי. זה צריך לעודד שיתופי פעולה בין קבוצות מחקר מחוץ למוסדות אלה והקבוצות עם התמחות בדוגמנות בעלי חיים רומן כזה.
אמנם תלוי בהיכרות עם ההדמיה אולטרסאונד וחלק מיומנות ידנית, מודל זה הוא קל ללמוד תחת הדרכה מוסמכת. צעד מפתח בתהליך הוא היצירה של submucosally מרחב מלאכותי בדופן השלפוחית עם מי מלח. ברגע שהמרחב הזה נוצר בלי o הניקובf השכבה הרירית, הוא נשאר יציב במשך כמה דקות. הדרכתו של המחט השנייה לתוך המרחב הזה כדי לחסן את התאים הסרטניים היא יחסית פשוטה. הסיבוך העיקרי ביצירתו של מרחב Submucosal הוא ניקוב של המחט לתוך לומן שלפוחית השתן. יצירת מרחב Submucosal, לעומת זאת, נשארת ריאלי. המחט צריכה להיות נסוגה לאט אל תוך קיר שלפוחית השתן והמלוח מוזרק רק כאשר השכבה הרירית מתהפכת קצה המחט. לאחר תרגיל זה השטח Submucosal הוא פחות יציב (מלוח יברח ללומן השלפוחית בתוך 30-60 שניות) וההזרקה של תאי גידול צריכה להתבצע במהירות. דליפה של תאים סרטניים לתוך לומן שלפוחית השתן יכולה להתרחש במקרים אלה עם ניקוב של הרירית. למרות האובדן של תאים סרטניים ממקום ביצוע העצמי עלול להוביל לירידה בגידול במהלך מעקב נפח, יש לנו מעולם לא נצפה כל ספיגת גידול שלפוחית.
אחר ג הפוטנציאליomplication היא דליפה של תאים סרטניים לחלל הצפק דרך ערוץ ההזרקה. אנו נצפו רק אחד הפצת תאים הסרטני intraperitoneal ב50 בעלי חיים, וזה קרה באחד מהניסיונות הראשונים שלנו. אנו מייחסים את זה לזריקה של גדול מדי תאים סרטניים השעיה נפח. זה נתמך על ידי העובדה שהקטנת הנפח 50-40 μl לא גרמה לדליפת intraperitoneal נוספת.
חיסון פולשנית זו של xenograft סרטן שלפוחית השתן orthotopic העכברית מייצג שינוי חדשני של "מודל ביצוע העצמי" הקיים, benefitting גם החוקר ובעלי החיים באותה מידה. היתרונות של מודל זה מעודדים את ההסתגלות שלה לאיברים אחרים כגון כליות, ערמונית וכבד על מנת לבסס גידולי xenograft orthotopic באופן מינימאלי פולשנית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר אליאנה Beraldi לביצוע התמרה ויראלית של שורות תאים סרטניים ובן Deeley להוראתו על שימוש בפלטפורמת ההדמיה אולטרסאונד בעלי החיים הקטנה.
פרויקט זה נתמך על ידי מערכת הגרמנית הקרן (DFG; JA 2117/1-1: 1), האגודה למלחמה בסרטן הקנדית מכון המחקר ופרס מדען רופא המורה רוחני מונקובר חוף בריאות מכון מחקר. פלטפורמת ההדמיה אולטרסאונד מומנה על ידי הקרן הקנדית עבור חדשנות.
Materials
| Chlorhexidine gluconate (2%) | Aplicare | 82-319 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3008101 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH3007103 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 356234 | Keep between 2-4⁰C |
| Isoflurane | Baxter Corporation | 402-069-02 | |
| Trypsin (0.25%) | Thermo Scientific | SH3004202 | |
| Syringe (1ml) | BD Bioscience | 309659 | |
| Hypodermic needle (30G; ¾ inch) | Kendall | 830340 | |
| Angiocatheter (24G) | BD Bioscience | 381112 | |
| Vevo 770 small animal imaging platform | VisualSonics | ||
| RMV 706 ultrasound scanhead | VisualSonics | ||
| IVIS Lumina III | Caliper Life Science |
References
- Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU Int. 104, 1286-1291 (2009).
- Kubota, T. Metastatic models of human cancer xenografted in the nude mouse: the importance of orthotopic transplantation. J. Cell. Biochem. 56, 4-8 (1994).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU Int. 100, 1377-1384 (2007).
- Kang, M. R., et al. An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Dobek, G. L., Godbey, W. T. An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Fu, C., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. Mouse Bladder Wall Injection. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Xiao, Z., et al. Characterization of a novel transplantable orthotopic rat bladder transitional cell tumour model. Br. J. Cancer. 81, 638-646 (1999).
- Iinuma, S., Bachor, R., Flotte, T., Hasan, T. Biodistribution and phototoxicity of 5-aminolevulinic acid-induced PpIX in an orthotopic rat bladder tumor model. J. Urol. 153, 802-806 (1995).
- Jäger, W., et al. Hiding in plain view: Genetic profiling reveals decades old cross-contamination of bladder cancer cell line KU7 with HeLa. J. Urol. (13), (2013).
- Horiguchi, Y., Larchian, W. A., Kaplinsky, R., Fair, W. R., Heston, W. D. Intravesical liposome-mediated interleukin-2 gene therapy in orthotopic murine bladder cancer model. Gene Ther. 7, 844-851 (2000).
- Dinney, C. P., et al. Isolation and characterization of metastatic variants from human transitional cell carcinoma passaged by orthotopic implantation in athymic nude mice. J. Urol. 154, 1532-1538 (1995).
- Black, P. C., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106, 1799-1804 (2010).
