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环境科学

Optimisé coloration négative: un protocole à haut débit pour examen petites et asymétrique structure des protéines par microscopie électronique

Published: August 15, 2014
doi:
10.3791/51087
, ,
1Lawrence Berkeley National Laboratory,The Molecular Foundry

Summary

Plus de la moitié des protéines sont de petites protéines (masse moléculaire <200 kDa) qui sont difficiles pour les deux électrons imagerie de microscope et des reconstructions tridimensionnelles. Coloration négative optimisé est un protocole robuste et à haut débit pour obtenir un contraste élevé et des images de petites protéines ou des complexes asymétriques dans différentes conditions physiologiques résolution relativement élevée (~ 1 nm).

Abstract

Détermination de la structure des protéines est plutôt difficile pour les protéines de masse moléculaire entre 40 – 200 kDa. Étant donné que plus de la moitié des protéines naturelles ont une masse moléculaire comprise entre 40 – 200 kDa 1,2, une méthode robuste et à haut débit d'une capacité de résolution nanométrique est nécessaire. Coloration négative (NS) microscopie électronique (EM) est une approche facile, rapide et qualitative qui a souvent été utilisé dans les laboratoires de recherche d'examiner les interactions de structures de protéines et protéines-protéines. Malheureusement, les protocoles de NS conventionnels génèrent souvent des artefacts structurelles sur les protéines, en particulier avec les lipoprotéines qui se forment habituellement exposer des artefacts Rouleaux. En utilisant des images de lipoprotéines de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) en tant que norme, les paramètres clés de NS conditions de préparation de l'échantillon ont été récemment examinés et présentés comme le protocole optimisé NS (OPN), un protocole NS classique modifié 3. Artefacts comme rouleaux peut être fortement limitée par NPO, fournissant en outre un contraste élevé avec assez haute résolution (près de 1 nm) des images de petites et asymétriques protéines. Ces images à haute résolution et un contraste élevé sont même favorables à une protéine individuelle (un seul objet, pas de moyenne) reconstruction 3D, tel qu'un anticorps 160 kDa, par la méthode de tomographie électronique 4,5. En outre, OPNS peuvent être un outil à haut débit à examiner des centaines d'échantillons de petites protéines. Par exemple, le mécanisme précédemment publiée de 53 kDa de la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP) impliqué l'examen d'imagerie et de centaines d'échantillons 6. Considérant cryo-EM rarement avec succès images protéines inférieure à 200 kDa n'a pas encore publié une étude portant sur le dépistage plus d'une centaine conditions de l'échantillon, il est juste d'appeler OPNS une méthode à haut débit pour l'étude de petites protéines. Espérons que le protocole OPNS présenté ici peut être un outil utile pour repousser les limites de EM et d'accélérer les études électromagnétiques dans petite structure de la protéine, la dynamique et les mécanismes.

Introduction

La compréhension de la fonction des protéines nécessite la connaissance de la structure des protéines. Détermination de la structure est difficile pour des protéines dont les masses moléculaires sont à 40 – 200 kDa. Cristallographie aux rayons X est limitée par la cristallisation des protéines; résonance magnétique nucléaire (RMN) est limitée à des masses moléculaires inférieures à 40 kDa, alors que cryo-microscopie électronique (cryo-EM) a des difficultés à la fois l'acquisition de l'image et en trois dimensions (3D) des reconstitutions de petites protéines, dont les masses moléculaires sont inférieures à 200 kDa. Notamment, plus de 50% de protéines ont une masse moléculaire dans la gamme de 40 – 200 kDa 1,2, comme les méthodes actuelles sont difficiles à étudier des protéines de cette taille, une nouvelle méthode est nécessaire.

Bien que la plupart des microscopes électroniques à transmission (TEM) sont capables de la résolution atomique, c'est à dire, mieux que 3 Å de résolution, la réalisation même une structure proche de résolution nanométrique à partir d'un des échantillons biologiques est assez défging 7. dégâts d'irradiation, faible contraste, les écarts structurels ainsi que des artefacts tels que la déshydratation nuisent tous à haute résolution TEM imagerie 3,8.

Parmi les diverses approches de TEM, cryo-EM est une méthode d'arête de coupe de pointe et de réaliser des structures de résolution atomique de grandes macromolécules hautement symétriques dans des conditions physiologiques proches de 9-12. L'échantillon cryo-EM est préparé éclair congélation de la solution d'échantillon, l'intégration dans les macromolécules glace vitreuse, qui est ensuite imagé à des températures cryogéniques, tels que la température du liquide de l'azote ou de l'hélium 13. Cryo-EM est avantageux en ce que les échantillons ne présentent aucun des artefacts et sont presque natif dans la structure 8-12. Cryo-EM a ses inconvénients: i) des dispositifs supplémentaires sont nécessaires pour être installé ou acheté pour mettre à jour un instrument de TEM standard pour une capacité cryo-EM. Les dispositifs comprennent: anti-contaminateur, porte-cryo, logiciels en mode à faible dose et sensi faible dosecaméra CCD tive, bien que les prix de ces appareils sont beaucoup plus bas que le prix de l'instrument de TEM elle-même; ii) le fonctionnement cryo-EM a besoin plus de temps que l'opération NS. Examen d'un échantillon cryo-EM nécessite souvent plus de temps pour préparer des échantillons et faire fonctionner l'appareil de TEM que celle de NS parce cryo-EM, il faut traiter des difficultés supplémentaires, y compris: liquide opération de température de l'azote, l'échantillon de charge, la dérive de l'imagerie, des gradients de température, à faible dose opération de modèle, l'échantillon sensibilités de rayonnement et les limites de dosage. Ces mesures supplémentaires vont ralentir la vitesse d'acquisition des données utiles par rapport à l'acquisition de données NS, bien que quelques images cryo-EM peuvent certainement être obtenus en 1 heure ou moins par des experts cryo-EM avec l'instrument préparé avec un gradient de température équilibrée; iii) les utilisateurs ont besoin de formation supplémentaire, comme la manipulation de l'azote liquide, gel grilles cryo-EM, un fonctionnement à faible dose, la mesure de la dose, la manipulation de la charge, à la dérive et de la connaissance dans l'imagerie processer; iv) l'absence d'imagerie reproductible pour les mêmes cryo-échantillon au cours des différentes séances de TEM. Spécimens Cryo-EM sont facilement endommagées par la contamination de la glace pendant spécimen chargement et le déchargement de / vers l'instrument TEM. Ce dommage est particulièrement préoccupant lorsque les échantillons sont difficiles à être isolé / purifié 14; v) de petites protéines (<200 kDa de masse moléculaire) sont difficiles à imager en raison du faible contraste; vi) le faible contraste et de bruit élevé des images cryo-EM réduit la valeur de corrélation croisée entre les images, par conséquent, diminuer la précision globale de la détermination des orientations de protéine, les conformations et les classifications, en particulier pour des protéines qui sont structurellement souple et varient naturellement en solution 4,5.

Coloration négative (NS) est relativement "ancienne" et méthode historique de tout laboratoire, avec n'importe quel type EM, peut utiliser pour examiner la structure de la protéine. Brenner et Horne d'abord développé le concept of de coloration, il ya un demi-siècle négatif pour l'examen de virus 15. NS est réalisé par enduction de l'échantillon avec des sels de métaux lourds chargées. Ce concept originaire d'microscopie optique et la pratique de l'intégration des bactéries dans une solution de tache fournir obscurité autour des spécimens, ce qui permet plus contraste de l'image lors de la visualisation de l'image négative 16. Etant donné que les ions de métaux lourds ont une plus grande capacité de dispersion des électrons par rapport aux atomes moins denses dans les protéines de 17 à 20, et aux taches revêtement de métal lourd permet une limitation de la dose la plus élevée avec un contraste amélioré. Spécimen NS peuvent fournir des images à contraste élevé 8 pour faciliter la détermination de l'orientation des particules et de la reconstruction 3D que les images de cryo-EM.

NS traditionnels, malheureusement, peuvent produire des artefacts induits par les interactions protéines-tache, comme l'agrégation général, la dissociation moléculaire, d'aplatissement et d'empilage 8,21,22. Pour lipides liés proteins, comme les lipoprotéines 16,23-30, un des résultats de l'artefact commun dans les particules qui sont empilés et emballés ensemble dans un rouleaux (Figure 1) 31-36. De nombreuses études de lipoprotéines, comme l'électrophorèse sur gel non dénaturant de polyacrylamide gradient, cryo-EM étudie 13,29,37-40, 39,41 spectrométrie de masse, et les données de diffraction de petits angles de rayons X 42 montrent toutes les particules sont des particules de lipoprotéines isolées au lieu d'empiler naturellement un ensemble formant rouleaux 21,29,30,35,42-45. L'observation de la formation de rouleaux par NS classiques est peut-être causée par des interactions dynamiques entre les lipoprotéines composées des apolipoprotéines (apo) et des phospholipides qui sont structurellement souple en solution 13,29,30,46-49 et la sensibilité au protocole NS standard. Pour identifier cet artefact, l'apolipoprotéine E4 (ApoE4) palmitoyl-oleoylphosphatidylcholine (POPC) lipoprotéines de haute densité (HDL) échantillon ont été utilisés comme un échantillon de test et la cryogénieImages EM pour une norme sans artefacts 29, le dépistage des spécimens NS préparés sous une série de conditions. En comparant les tailles de particules et de formes obtenues à partir de NS et cryo-EM, le type de réactif de coloration et de la concentration en sel se sont révélés être de deux paramètres essentiels provoquant les phénomènes Rouleaux bien connus. Ainsi, un protocole coloration négative optimisé (NPO) a été signalé.

Par OPNS, le phénomène bien connu de rouleaux de apoE4 HDL a été éliminé par OPNS (figure 2A). L'analyse statistique a démontré OPNS rendements des images très semblables (moins de 5% d'écart) de taille et de forme par rapport à ceux de cryo-EM, mais le contraste a été éliminé. Les validations des OPNS ont été réalisées par l'examen de l'élimination de l'artefact de rouleaux de la quasi-totalité des classes ou sous-classes de lipoprotéines échantillons de 6,29,30,50,51, notamment l'apoA-I de 7,8 nm (figure 2B), de 8,4 nm (figure 2C) , 9,6 nm discoidal reconstitué HDL (rHDL) (figure 2D), 9,3 nm sphérique rHDL (figure 2E), HDL humaine plasmatique (figure 2F), le lipide libre apoA-I (figure 2G), le HDL plasmatique (figure 2H), lipoprotéines de basse densité (LDL ) (figure 2I), une lipoprotéine de densité intermédiaire (IDL) (Figure 2J), lipoprotéines de très basse densité (VLDL) (figure 2K), et des liposomes POPC (figure 2L) 30. Validations supplémentaires ont été réalisées par l'imagerie des petits et asymétriques protéines, y compris la 53 kDa protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP) (Figure 3A – C) 6,29, et très flexible 160 kDa anticorps IgG (figure 4A et B) 4,5,29 , 52, et deux protéines de structure bien connue, et GroEL protéasome (figure 2 M et N). Pour nécessiter de validation supplémentaire de colleagues, nous sommes ouverts à toutes tests à l'aveugle sur cette méthode OPNS.

OPNS comme un protocole à haut débit a également été utilisée pour étudier le mécanisme de la protéine par l'intermédiaire de l'examen des centaines d'échantillons de petites protéines, telles que la CETP qui a été lient à diverses protéines de moins d'une des conditions de la série (y compris la CETP interaction à quatre classes de lipoprotéines, recombiné HDL, plasma HDL, LDL et VLDL, avec / sans 2 anticorps, H300 et N13, sous 9 fois d'incubation, y compris 3 min, 20 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h et 72 h, moins de quatre rapports molaires, à savoir 1: 0,5, 1: 1, 1: 2, 1: 4, et les trois dilutions, à savoir 0,1 mg / ml, 0,01 mg / ml et 0,001 mg / ml, ainsi que des échantillons de contrôle additionnels, y compris CETP seul, LDL seul, et VLDL seul, avec triples tests d'expériences ci-dessus par des personnes différentes) 6,29. OPNS images de la CETP fourni des images à contraste élevé avec assez petits détails structurels; nous permettant de reconstruire une carte de densité 3D de 53 kDa sma succèsprotéine CETP II (Figure 3D – F) par la reconstruction de particules unique. En outre, les images à fort contraste OPNS nous fournissent un signal suffisant d'une protéine individuelle (figure 4A – C), qui nous a permis d'atteindre la résolution intermédiaire (~ 1,5 nm) d'un seul (un objet, pas de moyenne) la structure d'anticorps IgG 3D via la méthode (Figure 4E – J) tomographie électronique individu de particules (IPET) 5. La description détaillée de la stratégie IPET de reconstruction, de la méthodologie, processus étape par étape et l'analyse de la variation structurelle ont été précédemment rapporté 4. Un film sur les procédures de reconstruction d'anticorps IPET, y compris les images brutes et les résultats intermédiaires, carte de densité 3D et accueil structurelle était aussi la disposition du public par ligne sur YouTube 5. Comparaison des reconstructions 3D à partir de différentes particules anticorps individuels pourrait révéler la dynamique de protéines et conformational changements au cours des réactions chimiques 4,5.

Considérant que plus de 50% de protéines ont une masse moléculaire allant de 40 à 200 kDa 1,2, le succès dans l'imagerie de ces petites protéines en témoigne cette méthode OPNS est un outil utile pour pousser les frontières de EM classique vers les petites et asymétriques déterminations structurelles et découvertes mécanisme . Ainsi, le protocole détaillé est fourni ci-dessous.

Protocol

1 Préparation de la solution de coloration fraîche négatif à 1% (p / v) Mettez 1 mg Uranyle formate (UF) de poudre dans une bouteille en verre contenant 100 ml d'eau déminéralisée dans une pièce sombre ou boîte. Agiter la solution O / N à la température ambiante dans une chambre / boîte sombre. Envelopper la bouteille de solution avec du papier d'aluminium pour empêcher la lumière de frapper la solution. Filtrer la solution à travers doucement 0,2 pm (taille des pores) filtre monté sur une seringue de 5 ml. La solution filtrée a été recueilli dans des tubes Falcon plusieurs couverts d'une feuille d'aluminium. La seringue de filtre doit être enveloppée d'un papier d'aluminium pour empêcher l'exposition de la lumière. Filtrer la solution à travers de nouveau 0,02 pm (taille des pores) monté sur filtre seringue de 1 ml. La solution filtrée a été recueilli et aliquote dans des flacons de 2 ml. Les seringues et des flacons étant recouvertes d'une feuille d'aluminium avant de les utiliser. Geler immédiatement les flacons aliquotes en utilisant une pince à long manche, submergeant les flacons dans un récipient rempli d'azote liquideaprès que la solution a été filtrée. Transférer les flacons congelés dans un congélateur à -80 ° C pour le stockage et l'utilisation future. 2 Préparation du poste de travail négatif de coloration et d'incubation Workstation Décongelez un flacon de solution UF 1% dans un bain-marie réglé à la température ambiante. Assurez-vous que la feuille d'aluminium reste enroulé autour du flacon pour éviter l'exposition à la lumière. Filtrer la solution après qu'elle soit complètement décongelé à l'aide d'une feuille d'aluminium enroulée seringue de 1 ml monté avec un filtre 0,02 pm. Recueillir la solution filtrée dans une nouvelle feuille d'aluminium flacon enveloppé, et l'a placé sur la glace dans une boîte de glace de chapeau couvert d'attente pour l'utilisation. Faire plaques de solution par un doigt de poussée longue feuille de Parafilm ~ 8 de pouce sur la surface d'une plaque de cristallisation de protéines vide. Il va générer des rangées de plaques circulaires avec un diamètre d'environ 5 mm. Faire 6 assiettes à chaque endroit de la ligne les plaques Parafilm sur une surface de glace aplati à l'intérieur d'une glace contiennentcouvercle er, comme un poste de travail de coloration. Pipette ~ 35 ul d'eau désionisée sur chacune des trois plaques de gauche dans chaque rangée, et pipettes ~ 35 ul filtrés solution UF à droite, trois plaques dans chaque rangée. Couvrir le poste de travail de coloration avec un couvercle pour éviter toute exposition à la lumière avant la coloration des protéines. Préparer une station d'incubation de la grille EM par remplissage d'une boîte vide à mi-chemin avec de la glace, et ensuite collé à un élément de suspension qui peut être monté sur une base de support. Placez la pince à épiler de l'échantillon dans le hangar, dans lequel les conseils des pinces sont proches de la surface de la glace. La moitié couvre les conseils des pincettes par la hauteur boîte de lèvre. Une boîte de glace idéal pour faire une station d'incubation utilise une embouts de pipette contenant vide. 3. OPNS opération Décharge luminescente du film mince de carbone recouvert de 300 mailles des grilles EM de cuivre pendant 10 sec. Procurez-vous un réseau avec des pincettes et accrocher la pince à épiler dans le cintre en gardant la grille à 45 ° d'inclinaison et 1 pouce au-dessus de la glacesurface à l'intérieur de la station d'incubation. Diluer l'échantillon de protéines avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD) à une concentration finale en protéine de 0,01 ~ à ~ 0,005 mg / ml. 4 pi ~ fort dilué l'échantillon immédiatement après la dilution du côté de la grille EM du carbone. (DPBS peuvent être modifiés à un autre tampon si la protéine est sensible à DPBS) Incuber l'échantillon sur les grilles EM ~ 1 min à l'intérieur de la station d'incubation. Enlever l'excès de solution par l'intermédiaire de toucher rapidement le bord de la grille avec un papier filtre. Appuyez sur la grille rapidement à la première goutte (~ 35 pi) de la surface de l'eau pure au sommet de la feuille Parafilm juste après l'excès de solution a été retiré sur la grille de EM. Et puis enlever l'excès d'eau rapidement avec un papier filtre. Répétez l'étape 3.6 pour encore deux fois par lavage de la grille EM sur les deux gouttes d'eau restantes sur le parafilm (étape 3.6 et 3.7 peuvent être ignorées si l'échantillon est très sensible à l'eau). Faire flotter le gri EMD immédiatement sur la surface de la première goutte de UF solution juste après l'excès d'eau sur la grille EM a été retiré. Et puis incuber pendant 10 sec. Assurez-vous de terminer les procédures de lavage de l'eau à moins de 3 secondes avant la grille flottante sur la surface de la solution UF. Plus le temps de lavage, meilleure est la qualité sera. Nettoyer la pince à épiler en pénétrant dans les conseils dans un papier filtre pour ~ 2 – 3 fois. Retirer l'excès de solution sur la grille par contact avec le bord de la grille avec le papier filtre, puis flotter la grille de la deuxième baisse de l'UF. Continuer étape ci-dessus 3.10 sur la deuxième goutte. Flotter la grille sur le troisième gouttelette de solution UF et couvrir le poste de coloration pour ~ 1 min. Etape facultative: laver la grille rapidement sur une surface de l'eau comme décrit au paragraphe 3.6. Cette étape supplémentaire bénéficiera échantillons contenant plus de particules d'or libres chargés ou tache de fond. Enlever l'excès de solution en contact avec le papier-filtre de the ensemble de grille arrière (opposée à la face de carbone). Séchez la grille sous un léger courant d'azote gazeux à température ambiante juste après l'observation d'absorption sur le papier filtre la solution. Placez la grille sur une feuille de papier filtre dans une boîte de Pétri, et couvrir le plat partiellement avec un capuchon à sécher pendant au moins 30 min sous RT. Pour certains échantillons, placer la grille dans un incubateur à 40 ° de la cuisson pendant une heure. Rangez la grille dans une case de la grille de EM pour l'avenir EM examen. 4. EM examen Alignez le TEM correctement avant EM examen des petites protéines sur la grille. Vérifiez la résolution de la plus haute Thon-anneau visible qui est le spectre d'un film de carbone amorphe de puissance pour déterminer si le TEM a été aligné correctement. Depuis le TEM est partagée par de nombreux utilisateurs différents, le MET a souvent pas correctement aligné. Vérifiez soigneusement le spectre de puissance sur la zone de film de carbone de l'échantillon pour ajuster la conditio d'alignementn de la machine. Les plus fortes Thon anneaux visibles sont mieux que la résolution ciblée. NOTE: À titre d'exemple d'un bon alignement d'un TEM LaB6 à incandescence dont moins de 120 kV haute tension, plus de 20 Thon-anneaux peuvent être visualisées, dans lequel, la résolution correspondante peut être mieux que 5,0 Å. Cette Thon torique a été obtenue par transfert de Fourier d'un film de carbone amorphe sous une défocalisation imagée de ~ 1,6 um et une dose de 20,4 e / A2 (figure 5). REMARQUE: Observation de la haute résolution Thon-anneau est une condition nécessaire, mais pas une condition suffisante pour un bon alignement. Pour réaliser effectivement les images à haute résolution, de nombreux autres paramètres sont également importants, tels que la qualité de l'échantillon, dégâts d'irradiation, de charge et de la dérive ainsi que le débit de dose d'éclairage. Apportez la défocalisation revenir à près de Scherzer mise au point pour l'imagerie des petites protéines sur une zone idéalement teinté. Recherche pour la zone "trouble" à image. Une zone idéalement coloré est habituellement situé à proximité du bord de la surface de la tache plus épais, ce qui ressemble à un domaine "trouble" sur la grille depuis l'épaisseur de la tache n'est généralement pas répartie uniformément sur ​​la grille recouverte de carbone (Figure 6). Généralement, un faible grossissement (<100x) était d'aider à trouver ces zones nuageuses avant de zoom pour l'imagerie.

Representative Results

Les mises en œuvre de OPNS comprennent les examens morphologiques et structurales des diverses espèces telles que les lipoprotéines: HDL naissante recombinant (rHDL), HDL recombinant sphérique, HDL plasmatique, LDL, IDL et VLDL (figure 2) 30; ainsi que les petites protéines telles que 53 kDa CETP (parmi les plus petites protéines imagées avec succès par EM) (Figure 3) 6 et des anticorps IgG (160kDa une des protéines les plus dynamiques et hétérogènes) (Figure 4) 4,5,29,52 , même de 28 kDa libre lipide apolipoprotéine A-1 (figure 2L), et GroEL et protéasomes (Figure 2 M et N). D'autres exemples de OPNS comme une méthode à haut débit examinent les interactions protéine-protéine pour découvrir les mécanismes de protéines, comme 53 kDa CETP. Comme décrit dans l'introduction, la façon dont la CETP interagit avec les différentes sous-classes de lipoprotéines sont InvestigaTed via l'examen de plus de 400 spécimens EM 6 Pour autant que nous savons, il n'y avait pas un cas d'étude cryo-EM qui consiste à dépister près d'une centaine des conditions différentes. OPNS peuvent repousser les limites EM pour étudier la structure asymétrique et petite protéine 3D et même s'étendre à obtenir la structure 3D former une protéine unique et individuel (sans en moyenne). Par exemple, l'anticorps IgG est de 160 kDa molécule ayant une structure très souple, dans lequel la reconstruction 3D à résolution intermédiaire est difficile à atteindre. le procédé OPNS a été utilisé pour l'image d'un anticorps IgG à partir d'un individu série d'angles de basculement (figure 4E et H). Les raisonnablement haute résolution et de protéines de contraste élevé des images de OPNS autorisées pour le succès de la reconstruction d'une protéine unique par individu tomographie électronique de particules (IPET) (Figure 4E – J) 4,5. En reconstruction IPET 3D <sup> 4, la série d'inclinaison 2D de l'anticorps ciblés ont été progressivement aligné à leur centre mondial calculé par reconstruction itérative la suite pour atteindre une densité de 3D ​​à une résolution de ~ 14,1 Å (Figure 4F et G) 4. Par la même approche, un seul complexe anticorps-peptide a été reconstruite, et le peptide induit le changement de conformation domaine interne d'une seule particule d'anticorps a été découvert (Figure 4E et J, la résolution ~ 16,6 Å) 4,5. En comparant les reconstructions 3D à partir de différentes particules individuelles, l'analyse structurelle peut nous permettre de révéler protéines fluctuations thermodynamiques, et même «instantané» les étapes intermédiaires d'une réaction chimique 4,5,29,53,54. En résumé, les protéines dont la masse moléculaire entre 40 kDa – 200 kDa sont difficiles pour les examens structurels EM standard et reconstructions. Considérant que plus de 50 protéines ont une masse moléculaire allant de 40 à 200 kDa 1,2, nous signaler une méthode OPNS comme un outil robuste et à haut débit à pousser les frontières de EM classique vers les petites et asymétriques déterminations structurelles et même des études mécanistiques. Figure 1 Rouleau artefact de lipoprotéines par coloration négative (NS) EM classique. Les micrographies électroniques (ci-dessus des panneaux) et des particules sélectionnées (ci-dessous des panneaux) montrent différentes lipoprotéines avec rouleaux après NS avec de l'acide phosphotungstique (PTA) selon la procédure de mélange standard. (A) reconstitué HDL (rHDL) avec ApoE4, (B) apoA-I contenant 9,6 nm discoïde rHDL, (C) contenant de l'apo B des LDL plasmatique, (D) des liposomes POPC non contenant l'apolipoprotéine. Bars: 50 nm. Taille de la fenêtre: A et C, n 20m; B, 30 nm. Le Journal of Lipid Research initialement publiée ce travail 29,30. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2 Structure de la protéine par coloration négative optimisé micrographies (OPN) EM électrons montrent diverses lipoprotéines et des liposomes sans artefact par OPNS rouleaux (A) contenant apoE4 rHDL,.. (B) de 7,8 nm rHDL, (C) 8,4 nm rHDL; ( D) de 9,6 nm rHDL, (E) 9,3 nm rHDL sphérique; (F) du plasma humain α-HDL, (G) le HDL plasmatique, (H) des LDL du plasma humain; (I) IDL de plasma humain; (J) de VLDL du plasma humain; <strong> (K) POPC liposome; (L) dépourvu de lipide apoA-I. Vérification supplémentaire a été effectuée à l'aide (M) GroEL et des échantillons (N) du protéasome. Micrographies (panneaux ci-dessus) et les particules sélectionnées (ci-dessous des panneaux). Bars: 50 nm. taille de la fenêtre: A – D, 20 nm; E et F, de 25 nm; G, 20 nm; H, 25 nm; I, 50 nm; J et K, 100 nm; L, 80 nm., Sauf lipides libre apoA-I, GroEL et du protéasome, Cette recherche a été publié dans le Journal of Lipid Research 29,30. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. microscope électronique OPNS de la CETP. (A) Vue d'ensemble micrographie de la CETP (pointillés cercles) des particules en forme de bananes. (B) WindoweD Sélectionnez particules brutes. (C) Trois images de particules de la CETP première simples montrant clairement, une pointe globulaire plus lourd et plus grand, y compris l'autre, pointe plus léger et plus étroit (panneau de gauche) plus petite, vue de dessus montrant les régions terminales similaires avec moins de courbure globale (milieu panneau), et à la fin vue sur le grand axe de la CETP (panneau de droite) (D) superposition de la structure cristalline (PDB:. 2OBD) sur ces images de particules de la CETP premières, correspond bien à la fois la forme et le domaine taille montrant la structure de l'orientation peut être presque directement définie, même sans assistance par ordinateur (panneaux correspondant à (C)). (E) de référence moyenne de classe 2D libres (un processus d'ab initio pour calculer les similarités (calcul de corrélation croisée) de ces particules orientées de façon aléatoire, les particules ayant une forte similarité entre eux ont été regroupés, aligné et ensuite la moyenne pour réduire le bruit de fond et amélioré la particule d'image concontraste. Les moyennes de la classe 2D libre de référence sont calculés par le logiciel refine2D.py dans le package de RESE, dans lequel, sans aucun modèle initial de l'homme fait a été impliqué dans cette moyenne de la classe. Les moyennes de la classe de référence peuvent être utilisés comme une méthode indépendante pour valider la reconstruction 3D de la reconstruction mono-particule). (F) moyennes de la classe 2D de référence gratuits sélectionnés montrent une extrémité distale plus grande par rapport à l'autre. (G) structure cristalline superposé (APB : 2OBD) par rapport à la moyenne de référence gratuits, les images de superposition montrent un près de correspondances parfaites entre la structure cristalline et de classe moyenne sans référence à la fois dans la forme de la structure et de la taille de domaine (faible panneau) (F) carte de densité 3D de la CETP à un. résolution du 13 Å a été reconstruite à partir de 8879 particules imagés par NPO et la méthode de reconstruction unique de particules (en haut) et le corps strié amarré dans cette reconstruction une particule par la structure cristalline (faible du panneau). La detinformations ailed de la reconstruction de particules unique, y compris prétraitement de l'image, le modèle initial, les procédures de raffinement, de la distribution de l'angle et de Fourier Shell Correlation (FSC) ont été publiés dans la section de la méthode et information à l'appui de l'article original (H) de comparaison final de la reconstruction de particule ( dessus du panneau) et la comparaison ajustement APB supplémentaire (panneau inférieur) 6. Bars: A, 50 nm; B – D, 10 nm; F, 3 nm. Certains de ces chiffres ont déjà été publiés dans la revue Nature Chemical Biology 6. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4 OPNS images et des reconstructions de l'IgG humaine particules 1 d'anticorps. (A) Au coursvue d'images IgG1 anticorps OPNS humaines. Particules représentées dans les cercles blancs montrent clairement les particules avec 3 sous-domaines. (B) sélectionné des images brutes à haute résolution de cinq particules individuelles non conjugués anticorps et (C) leurs images à bruit réduit correspondants en réduisant manuellement bruit environnant bord de particules bruts (sans toucher tout densité des particules à l'intérieur) de visualiser facilement. (D) La structure cristalline (PDB entrée de 1IGT) de l'anticorps IgG1 qui a été orienté à un affichage de manière similaire aux images EM. La comparaison des images correspondant présente de nombreux points communs entre l'image de EM et de la structure cristalline, y compris les positions de domaine et de formes. (E) Le mode opératoire de l'une reconstruction ab initio 3D à partir d'un anticorps à une seule instance d'IgG1 étape à l'étape (a pas moyen, un objet individuel) en utilisant la méthode de tomographie électronique individu de particules (IPET). (F) La reconstruction 3D finale d'un siparticule d'anticorps ngle à résolution de 14,1 Å montré trois en forme de beignet domaines formant une forme en «Y». (G) Docking les structures des domaines de cristaux dans chacun des correspondants densité de domaine des cartes, respectivement, et en répétant manuellement les boucles entre les domaines. (H) La procédure pas à pas de la reconstruction 3D d'un seul complexe IgG-peptide (aucune moyenne, un objet individuel) par IPET. (I) La reconstruction 3D finale d'un complexe peptide IgG a été affiché à la résolution de 16,6 Å montré trois tige des domaines de forme formant en forme de "Y" (J), respectivement, l'amarrage de la structure cristalline de chaque IgG domaines d'anticorps (PDB d'entrée: de 1IGT). dans chaque tige densités de forme montrent un mal assorti avec des structures cristallines de domaine, ce qui suggère un changement conformationnel du domaine interne après conjugaison peptide. La procédure détaillée, l'analyse de la résolution et des statistiques ont été décrits dans le document original <sjusqu'à> 5 Bars: A, 50 nm; B – D, 10 nm. Ce travail initialement publiée dans la revue PLoS ONE 4 et 5 rapports scientifiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure spectre d'un film de carbone amorphe 5 Power imagé moins de 1,6 um défocalisation par un Zeiss Libra 120 LaB6 TEM. Imagerie à haute résolution nécessite suffisamment de preuves pour montrer que EM a la capacité d'alignement et de haute résolution appropriée. L'analyse du spectre de puissance de la zone de carbone à proximité sur la grille est une méthode efficace pour vérifier l'état de cohérence du faisceau avant l'acquisition des données. transfert de Fourier de l'image d'une zone du carbone amorphe correspond à la fonction de transfert de contraste d'instrument lié (C TF), ainsi appelé Thon toriques. Un alignement et une bonne cohérence peuvent être réfléchis par le nombre de Thon-anneaux visibles et la plus haute résolution d'anneaux Thon visibles dans une condition relativement élevé de défocalisation. A titre d'exemple d'une condition de l'alignement approprié près d'un LaB6 filament TEM équipée, plus de ~ 20 Thon anneaux (~ 5 Å) peuvent être générés à partir d'un film de carbone sont imagées à 1,6 um défocalisation utilisation de la dose de 20,4 e – / Å 2. Les anneaux Thon obtenus à partir d'un TEM bas de gamme ont une semblable à celle de TEM haut de gamme, comme une émission de champ pistolet (FEG) TEM amélioré exploité sous un état d'alignement bon. Ce travail initialement publié dans Scientific Reports 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 6highres.jpg "width =" 500 "/> Figure 6: Exemple micrographies des zones «idéales» pour l'imagerie OPNS. Trois échantillons de protéines, (A) GroEL (B) du protéasome (C) sphérique HDL, ont été utilisés comme exemples pour démontrer les OPNS idéales pour l'imagerie. Depuis les taches sont inégalement réparties dans l'échantillon, la faible grossissement de l'échantillon apparaît généralement "trouble" (à gauche panneau). Les zones idéales pour l'imagerie sont généralement situés dans les limites de ces "nuages". Un exemple de l'étape-par-étape de zoom dans une région «de trouble" de tache (panneau du milieu à gauche) montrer les images à fort grossissement présentant une haute résolution et un contraste élevé de particules (panneau au milieu à droite). Les images sélectionnées de particules montrent les détails de la structure des protéines (panneau de droite). Bars:. 30nm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une grandeversion r de ce chiffre. Figure 7 Un schéma de procédures OPNS. (A) la station grille EM d'incubation, d'une station simple à incuber la solution de l'échantillon sur la grille de préchauffage déchargée. (B) du poste de travail de coloration, conçu pour maintenir les gouttelettes de lavage de l'eau, et les gouttelettes de taches au-dessus d'un lit de glace, tout en minimisant l'exposition de la tache de lumière. (C) Vue d'ensemble de la procédure de coloration, illustrant: direction buvard, rinçage à l'eau 3 fois, 3 fois UF exposition de la tache, l'incubation de coloration avec la grille d'échantillonnage inversé sur les gouttelettes de teinture, et dernier échantillon d'arrière buvard pour assurer une mince couche d'une solution de coloration à l'échantillon avant le séchage par l'azote de l'air. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de eest la figure. Figure 8 haut – des images de résolution de 53kDa petite protéine CETP révélées par une méthode OPNS modifiée, cryo-positif-coloration (cryo-PS) Cinq sélectionnez haute résolution et la forme circulaire des images brutes masqués mous de particules CETP (avec inversion du contraste). et la forme des particules masqué particules brutes (réduction du bruit manuellement les bords des images de particules brutes de environnantes, mais sans modifier la densité dans les particules) de visualiser facilement. All-atome et la comparaison de la structure ruban de cristal pour masquées particules bruts alignés aux orientations similaires de chaque particule à images EM. Les détails à haute résolution des zones d'images brutes affichent certaine similitude avec la structure cristalline, tandis que pas toutes les fonctionnalités de la structure cristalline peuvent être résolus à partir des données brutes. Remarka rale, ces images brutes montrent similitude dans les deux extrémités terminales ayant à proximité de petits trous circulaires vus dans la réduction des images en mode manuel de bruit (triangles); En outre, les brins dans les régions C-terminales à l'intérieur des images de particules complètent la structure cristalline β-feuilles (flèches) et, enfin, des boucles en saillie sur la région CETP C-terminal sont analogues à la structure cristalline (losanges). (A) Cinq selection à haute résolution et de forme circulaire images douces masqués premières de particules CETP (avec inversion du contraste). (B) Bas de filtrage passe à 10A. (C) supérieur passe-bas filtrant à 20 Å. (D) masqués images manuellement bruit réduits. (E) Cristal comparaison de la structure par structure de ruban. comparateur de structure (F) Cristal de toute représentation de l'atome. Bar: 5 nm. Une partie de ce travail a été publié dans Nature Chemical Biology 6.raides "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 9 Micrographies électroniques de liposomes montrant la formation rouleau par protocole classique NS (PTA de tache) sous la salinité différente. (A) La salinité élevée (~ 0,5 MNaCl). (B) de la salinité normale (~ 0,25 M de NaCl). (C) à faible salinité (~ 0,1 M de NaCl). (D) de l'eau pure. Micrographies (dessus du panneau) et sélectionnez particules fenêtré (ci-dessous) panneau illustré. Bars: 100 nm. taille de la fenêtre: 80 nm. Le Journal of Lipid Research publié à l'origine de ce travail 30. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Par rapport aux techniques conventionnelles NS, OPNS peuvent éviter des artefacts Rouleaux (Figure 1 et 9), offrant haute résolution fiable et raisonnable (~ 1 nm) des détails structurels de petites protéines (Figure 2). Par rapport à la cryo-EM, OPNS fournit un procédé à haut débit et peut examiner une grande variété de protéines et d'interactions protéine-protéine 6. Cependant, OPNS a toujours ses inconvénients. Par rapport à NS classiques, OPNS implique: i) les mesures plus complexes dans la préparation des échantillons; ii) à l'aide d'une substance radioactive, UF; iii) le maintien de la tache fraîche en raison de la puissance de la tache inférieure UF raison de sa sensibilité à la lumière; iv) pour empêcher la précipitation de la solution UF doit être stocké dans -80 ° C et nécessite décongélation avant utilisation; v) et enfin tout UF doit être traité comme déchet dangereux. Par rapport à la cryo-EM, OPNS fournit relativement plus faibles des images de résolution et aucune garantie pour tout artefact pas encore découvertà l'avenir.

Effets procéduraux de fonctionnement NS sur la formation des lipoprotéines de rouleaux

NS protocoles pour la préparation de protéines pour examen 16,29-36,55 peuvent être classées en trois grands groupes de méthodes 50: mélange 55, goutte-à-goutte 16, et les procédures de lavage 29. i) Le protocole de mélange nécessite le mélange préliminaire de la coloration et de la protéine échantillon à un rapport spécifique, et ensuite l'application de la solution mélangée sur un film de carbone déposé sur une grille, enfin enlever l'excès de solution avec du papier filtre avant séchage à l'air pour EM examen 55. ii) Le protocole goutte-à-goutte comporte l'application (~ 4 ul) goutte de l'échantillon directement à une grille EM revêtue de sit permettant de carbone pendant environ 1 min, retirer ensuite la solution de l'échantillon en excès avant l'application d'une goutte (~ 4 pi) de la tache solution sur le même côté de la grille. Après ~ 1 min d'incubation, retirer les excess tache par contact avec du papier filtre propre, enfin soumettre à séchage à l'air 16,56-58. iii) Le protocole de lavage (Figure 7) nécessitant l'application de la solution échantillon à une grille EM revêtue de carbone pendant 1 min, puis lavage avec de l'eau désionisée trois fois à droite après avoir enlevé l'excès de solution à chaque fois par un papier filtre 3,29,30. OPNS protocole a été modifié à partir de cette procédure de lavage.

Types et les effets sur la formation des lipoprotéines de rouleaux taches NS

En Nouvelle-Écosse, la diffusion des électrons plus forte en raison de taches de métaux lourds fournir contraste des protéines 17-20,59. Échantillons NS peuvent en outre subir des doses plus élevées de rayonnement, et améliorer les caractéristiques de protéines par un contraste plus net négatif 8,9,60. Les taches de métaux lourds peuvent être classés comme suit: les tensioactifs anioniques, y compris l'acide phosphotungstique (PTA) 16, 14 et de la méthylamine tungstate tungstate de silicium 61; cation etic, tel que l'acétate d'uranyle (UC) 62, UF 3,29,30, et nitrate d'uranyle (ONU) 63. Une des taches NS anioniques qui est le plus couramment utilisé est le PTA 33,64-67. PTA est un hétéropolyacide, qui est généralement utilisé dans un pH de 7,0 à 7,5. PTA peut également être utilisé pour une coloration positive 3,16,68. Les charges négatives des PTA peuvent médiation des interactions électrostatiques avec des lipides insaturés chargés positivement groupes de tête, comme POPC, sur les deux surfaces de lipoprotéines et liposomes. PTA peut provoquer une formation de rouleaux à travers cette interaction 29,30 29,30 régulier même dans la salinité de la mémoire tampon (figure 1). taches d'uranyle, comme d'UC, UF et l'ONU sont des choix alternatifs pour cationiques métaux taches et UC lourds en particulier est fréquemment utilisé pour NS d'une variété de spécimens biologiques 62,69,70. Des expériences ont trouvé UF ne provoque pas de rouleaux de lipoprotéines contenant des lipides insaturés d'acides gras, comme les POPC. Cependant, UF peut encore induire rouleaux lipoprotéines de formation qui contient des lipides saturés d'acides gras, tels que la phosphatidylcholine de dimyristoyl (DMPC) et de 1-hexadécanoyl-2-octadécanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (PSPC). Le mécanisme détaillé de cette interaction n'est pas connue. UA / UF / ONU peut tous les travaux à des valeurs de pH inférieures allant de 3,5 à 4.6. De telles valeurs de pH plus faibles ne peuvent pas convenir à certaines macromolécules biologiques qui sont sensibles à un pH de 14,71. Fait intéressant, l'UA / UF peut fixer la structure des protéines en quelques millisecondes par un mécanisme inconnu 72. Contrairement PTA, UA / UF est plus semblable à un sel qu'un acide.

UF aurait peut donner de meilleurs résultats que 73 UA, dans lequel, les taches UF et de l'ONU ont des tailles de grains plus petits que d'UC (UF: 0,3 nm, de l'ONU: ~ 0,5 nm) 3,74. Un exemple intéressant, la structure-comme des détails secondaires d'une petite protéine (53 kDa CETP) peut être directement visualisé des micrographies premières quand UF a été utilisé comme réactif coloration négative par suite de latôt cryo-positif-coloration (cryo-PS) méthode (Figure 8) 6 rapporté. Dans cryo-PS, l'échantillon coloré était surgelé en suivant cryo-EM procédure de préparation des échantillons à la place de la procédure de séchage dans le protocole OPNS, ce qui peut provoquer l'effondrement de la structure secondaire. La cryo-PS est une méthode de contraste élevé et des images haute résolution des petites protéines 75. Depuis les images cryo-PS ont inversé contraste par rapport à ceux du protocole cryo-NS 22 signalé, mais ont cohérente contraste de l'image à celles des images cryo-EM classiques, donc il a été nommé la méthode cryo-PS. Les images cryo-PS montrent que le réactif de coloration, Uranyle formate, pénètre dans la surface moléculaire, contestant la vision conventionnelle que la coloration peut visualiser que la structure de surface extérieure. Le mécanisme de la manière dont le formiate d'uranyle pénètre dans la surface moléculaire est inconnue. Une possibilité est que le cation uranyle protéine se lie disponibles groupes carboxyle, et donc laentourant glace vitreuse est de densité inférieure à la coloration de la protéine et des groupes uranyle, agissant ainsi comme une tache positive. La méthode cryo-PS est similaire à la méthode remplacement isomorphe multiple (MIR), qui était une approche commune pour résoudre le problème de la phase de cristallographie aux rayons X 76-78. Dans MIR, des échantillons de cristal sont trempés avec une solution atome lourd, y compris l'uranium, pour obtenir une forme isomorphe à sa forme native. L'ajout de l'atome lourd parfois n'affecte pas les dimensions de la cellule de formation de cristaux ou unitaires, mais fournit des informations supplémentaires de la structure cristalline détermination 76-78. En bénéficiant du petit grain de UF, cryo-PS pourrait fournir un contraste élevé et une image haute résolution d'une seule protéine, ce qui est important pour les études de structures de protéines, surtout quand on considère que presque toutes les protéines sont naturellement dynamique et hétérogène en solution. Pour la validation de cette méthode cryo-PS, nous ouvrons à toute épreuve aveugle du champ EM. </p>

Sel effets de la concentration sur la formation de rouleaux dans les lipoprotéines

Utilisation de la ZEP traditionnelle réactif de coloration négative, la formation de rouleaux observée est plus probablement liée à des interactions lipides au lieu d'interaction des protéines. L'imagerie des échantillons de POPC vésicules de liposomes préparés selon la salinité considérable (0,5 M NaCl), la salinité moyenne (0,25 M NaCl), relativement faible salinité (NaCl 0,1 M), et de l'eau pure (Figure 9), les micrographies électroniques montrent la formation de rouleaux était corrélée à la concentration en sel (Figure 9A – D). Utilisation UF réactif de coloration négative, aucun des rouleaux a été observée dans POPC vésicule liposome échantillon 30 (figure 2L), ce qui suggère la procédure de lavage afin de réduire rapidement la concentration en sel juste avant la coloration est une condition nécessaire mais non pas indépendamment suffisante pour empêcher rouleaux dans POPC connexe échantillons.

<p class="Jove_content"> imagerie TEM petite protéine nécessite un état ​​de focalisation quasi-Scherzer.

Imagerie TEM réussie de petites protéines à plus haute résolution nécessite deux conditions critiques, un alignement correct du faisceau et un état d'acquisition de focalisation proche Scherzer. i) Un alignement correct du faisceau peut être évaluée en fonction du nombre de cycles (Thon visibles du spectre de puissance) sur le transfert de Fourier d'une image d'un film de carbone au titre d'un relativement haut défocalisation. La meilleure est la condition d'alignement de la poutre, les anneaux plus Thon peut être visualisé et mesurable l'image .. ii) L'acquisition en vertu d'un Scherzer près-focus est une autre condition critique. Une stratégie de norme traditionnelle pour imager des échantillons biologiques utilise généralement élevés défocalisation (1 – 2 pm et même plus), ce qui peut améliorer le contraste de l'image échantillon biologique 79. Cette stratégie est significatif différent de la stratégie classique pour imager la structure de résolution atomique de matériaux durs, qui souventutilise un accent Scherzer près (~ 50 nm de défocalisation). Bien que, d'une défocalisation plus élevé pourrait renforcer biologique contraste de l'échantillon, les signaux haute résolution seraient en partie éliminés. En conséquence, la complicité de signal à haute résolution serait inférieur à un état supérieur d'imagerie de défocalisation. La raison en est que, l'image de TEM est la convolution de la structure de l'échantillon et l'instrument de FCE. Le FCT est une courbe oscillant contre la fréquence, dans lequel la courbe souvent oscillé traversant amplitude zéro à haute fréquence. Chaque fois que la FCE à travers zéro, le signal de structure échantillon à cette fréquence spécifique sera éliminé (zéro fois un nombre est égal à zéro). Le signal à cette fréquence éliminée ne peut jamais être récupéré par n'importe quel algorithme de correction d'FCT (un zéro divisé par zéro peut être n'importe quel nombre aléatoire à la place du signal de structure d'origine). Sous supérieur imagerie de défocalisation, le FCT osciller beaucoup plus agressive, donc le FCT traverse amplitude zéro plus fréquemment, par conséquent,les signaux de structure à un plus grand nombre de fréquences spécifiques seront éliminés. Les plusieurs signaux qui sont éliminés, le moins la complicité de l'image auront. Notamment, la complicité de l'image ne peut pas être récupéré ou corrigée par une correction de la FCE. Cependant, un certain nombre d'images acquises sous différentes inachevées défocalise peut être utilisé pour remplir les lacunes à l'autre pour obtenir un signal de structure complet de la structure de l'échantillon au moyen d'un procédé de calcul de moyenne, dans lequel une même résolution atomique de 9 à 12 peut être obtenue.

La méthode de calcul de la moyenne est une approche puissante pour parvenir à la structure de certaines protéines hautement symétriques et des protéines structurellement apparentées rigides. Cependant, il reste encore difficile dans l'étude structurale des petites et asymétriques protéines, en particulier pour la dynamique des structures et des protéines flexibles, tels que des anticorps et HDL. Calcul de la moyenne est basée sur l'hypothèse que les particules de protéines sont identiques à la structure et la conformation mais différent dans les orientations, mais beaucoup de protéines sont connues pour subir fluctuation thermodynamique en solution. En appliquant la méthode de la moyenne sans connaître préalablement les protéines thermodynamiques fluctuations de fluctuation, la structure moyenne peut souvent provoquer des domaines ou 10,80 variation locale dans la résolution 81 dans les reconstructions cryo-EM manquant.

Le succès dans la réalisation de la reconstruction 3D de petites protéines, telles que 53 kDa de la CETP et de la structure 3D d'une protéine unique, tel que 160 anticorps kDa IgG1, les avantages de l'utilisation de la condition de formation d'image de mise au point proche Scherzer dans une condition d'alignement. Bien que le contraste de l'image semble faible dans les quasi-Scherzer images floues, le contraste peut être facilement améliorée en appliquant simplement un filtrage passe-bas pour réduire le bruit à haute fréquence dans le fond. Nous croyons, la quasi-Scherzer concentrer images véhiculent les signaux structurelles maximales, et peut augmenter la précision de l'alignement de particules et de renforcer l'efficacité dans la reconstruction 3D à une particule et particule individuelle reconstruction de la tomographie électronique.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Mickey Yang pour l'édition et commentaires, et les Drs. Lei Zhang Peng Bo et de l'aide. Ce travail a été soutenu par le Bureau de la science, Bureau des sciences fondamentales de l'énergie du ministère de l'Énergie des États-Unis (contrat n °. DE-AC02-05CH11231), le National Heart, Lung, and Blood Institute des National Institutes of Health (pas . R01HL115153), et l'Institut national de sciences médicales générales des National Institutes of Health (pas. R01GM104427).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Stain: Uranyl Formate The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc. 02545-AA http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml
SYRINGE: 1ML NORM-JECT VWR 89174-491 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491
Syringe filter: 0.2 μm  VWR 28145-487 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487
Syringe filter: 0.02 μm filter (Anotop 10) Whatman 6809-1002 http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline SIGMA-Aldrich D8537 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&region=US
Parafilm: 4 in. x 125 ft. VWR 470152-246 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A
Carbon film coated TEM grid: 300 mesh Pacific Grid-Tech Cu-300CN http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon
Carbon film coated TEM grid: 200 mesh EMS (Electro Microscopy Sciences) CF200-Cu http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx
Tweezer: Dumont Tweezer L5 EMS (Electro Microscopy Sciences) 72882-D http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5
Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System EMD Millipore Milli-Q Advantage A10 http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117
Filter Paper: Grade 1 circles Whatman 1001-090 http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx
Aluminum Foil NA NA Any type
Glow Discharge Unit Ted Pella 91000 http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10µL Pipettors VWR 89174-520 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520
Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40µL Pipettors VWR 89174-524 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524
Filter Tips: VWR Signature 200 µL Pipet Tips VWR 37001-528 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528
Pipet Pipetman F161201 and F167300 http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx
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Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (90), e51087, doi:10.3791/51087 (2014).
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