Protokollet för dynamisk longitudinell avbildning och selektiv laser skada i nervändar i reporter transgena möss presenteras.
Nervändar i huden är involverade i fysiologiska processer såsom att avkänna en liksom i patologiska processer, såsom neuropatisk smärta 2. Deras nära ytan positionering underlättar mikroskopisk avbildning av hudens nervändar i levande intakta djur. Med hjälp av multifoton mikroskopi, är det möjligt att få fina bilder övervinna problemet med starka ljusspridning i hudvävnaden. Reporter transgena möss som uttrycker EYFP under kontroll av Thy-1 promotor i neuroner (inklusive periferin sensoriska neuroner) är väl lämpade för longitudinella studier av enskilda nervändar över längre tidsperioder upp till flera månader eller till och med livslång. Dessutom använder samma femtosecond laser för avbildning, är det möjligt att producera mycket selektiva lesioner av nervfibrer för studier av omstruktureringen nervfiber. Här presenterar vi en enkel och tillförlitlig protokoll för longitudinell multifoton in vivo imaging ochlaserbaserade mikrokirurgi på mus hud nervändar.
Kutan nervändar genomgår dynamiska förändringar under olika patofysiologiska tillstånd. Nervtrådarna kan gå igenom processen för degeneration och regeneration eller omstrukturering under sådana sjukdomar som perifer neuropati 2 eller Mortons neurom 3. Efter traumatisk skada, är en viktig del av nervändar dynamik i huden reinnervation av det skadade området. Men den gemensamt tillvägagångssätt för undersökning av nervändar ex vivo histologisk snitt som saknar realtidsinformation om de pågående processerna 4. Med hjälp av genetiskt kodade fluorescerande markörer, är det möjligt att spåra nervändarna i huden på levande djur och på så sätt få rika och betydligt mer relevant information om de strukturella förändringarna. Undersökningen av kutana nervändar som är möjligt med konventionell fluorescensmikroskopi dock det starka ljusspridning i hudvävnaden gräver starkt kvalitetenav de uppgifter som förvärvat 5. Multifoton mikroskopi medger förvärv av högupplösta bilder i starkt spridande vävnader på grund av den icke-linjära summering av energin i excitation ljus fotoner som resulterar i utsläpp av fluorescens bara ur fokus för målet. Denna effekt leder till en robust ökning i penetrationsdjup och förbättring av signal-till-brusförhållandet för mätningen i hudvävnader 6. Med samma laser som för avbildning, är det möjligt att framställa selektiva dissektion av nervfibrer 7. I följande protokoll visar vi metoden för longitudinella avbildning av kutana nervändar i vivo i reporter transgena möss i kombination med selektiv laserskada med hjälp av kommersiellt tillgängliga multifotonmikroskopsystem.
I den här videon protokoll visar vi metoden för icke-invasiv longitudinell två-foton avbildning av enstaka nervändar.
Dynamiken i hud innervations påverkas vid sådana sjukdomar som psoriasis och perifer neuropati 2, och i traumatiska skador 9. Två-foton avbildning möjliggör detaljerad analys av nervfibrer strukturer i kollagenmatrisen. Användningen av transgena reporter möss hjälper till att undvika problemen med färgning av nervtrådar. Thy1-YFP-H-stammen …
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Neurotar Ltd för tekniskt stöd, CIMO Foundation och FGSN för ekonomiskt stöd.
Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
Ethanol 70% | |||
Distilled water or Milli-Q water | |||
Syringes 1ml | BD | 300013 | |
30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |