В Vivo Двухфотонное микроскопии Одноместный нервных окончаний в коже
Summary
Протокол динамической продольной томографии и селективной лазерной поражением нервных окончаний в репортера трансгенных мышей представлена.
Abstract
Нервных окончаний в коже участвуют в физиологических процессах, таких как зондирование 1, а также в патологических процессах, таких как невропатическая боль 2. Их близкие к поверхности позиционирования облегчает микроскопических изображений нервных окончаний кожи в живых интактного животного. Использование многофотонной микроскопии, можно получить высококачественные изображения преодоления проблемы сильного рассеяния света в ткани кожи. Репортер трансгенных мышей, которые выражают EYFP под контролем Thy-1 промоутера в нейронах (в том числе периферии сенсорных нейронов) хорошо подходят для продольных исследованиях отдельных нервных окончаний более длительных периодов времени до нескольких месяцев или даже всю жизнь. Кроме того, с помощью того же фемтосекундного лазера, как для визуализации, можно произвести высоко селективных поражения нервных волокон для исследования перестройки нервных волокон. Здесь мы представляем простой и надежный протокол для продольной МФ в естественных изображений ина основе лазера микрохирургии на мыши нервных окончаний кожи.
Introduction
Кожные нервные окончания пройти динамические изменения при различных патофизиологических состояниях. Нервные волокна могут пройти через процесс дегенерации и регенерации или реструктуризации в ходе таких заболеваний как периферическая нейропатия 2 или Мортона невромы 3. После травматического повреждения, важной частью нервных окончаний динамики в коже реиннервация из поврежденной области. Тем не менее, общий подход для исследования нервных окончаний является экс естественных гистологическое секционирования, что отсутствует информация о текущих процессах 4 в режиме реального времени. Использование генетически закодированные флуоресцентные маркеры, можно отслеживать на нервные окончания в коже живых животных, таким образом, получить богатую и значительно более соответствующую информацию о структурных изменениях. Исследование кожных нервных окончаний можно с помощью обычной люминесцентной микроскопии, однако, сильное рассеяние света от кожной ткани сильно подрывает качестводанных приобрела 5. Многофотонная микроскопия позволяет получать изображения с высоким разрешением в сильно рассеивающих тканей в связи с не-линейного суммирования энергии возбуждения световых фотонов в результате эмиссии флуоресценции только от точки фокуса объектива. Этот эффект приводит к надежной увеличения глубины проникновения и улучшение соотношения сигнал-шум для измерения в тканях кожи 6. Используя ту же самую, что и для лазера изображений, можно произвести избирательное рассечение нервных волокон 7. В следующем протоколе мы покажем метод продольной томографии кожных нервных окончаний в естественных условиях в репортера трансгенных мышей в сочетании с селективного лазерного поражения с использованием коммерчески доступного систему многофотонное микроскопа.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом видео-протокола мы демонстрируем метод неинвазивной продольной двухфотонного визуализации одиночных нервных окончаний.
Динамика иннервации кожи влияет при таких заболеваниях, как псориаз и периферической нейропатии 2, и при травматических повреждениях <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Neurotar ООО для технической помощи, КПМН фонда и FGSN за финансовую поддержку.
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
References
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Wu, K. K. Morton’s interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
- Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
- Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
- Sacconi, L., O’Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
- Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
- Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
- Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).
