In Vivo to-foton mikroskopi av Enkeltnerveender i hud
Summary
Protokollen for dynamisk lengde bildebehandling og selektiv laser lesjon av nerveender i reporter transgene mus er presentert.
Abstract
Nerveendene i huden er involvert i fysiologiske prosesser slik som å avføle 1 samt i patologiske prosesser så som nevropatisk smerte 2. Deres nær-til-overflate posisjonering forenkler mikroskopisk avbildning av huden nerveender i levende intakt dyr. Ved hjelp multiphoton mikroskopi, er det mulig å oppnå gode bilder overvinne problemet med sterk lysspredning av hudvev. Reporter transgene mus som uttrykker EYFP under kontroll av Thy-en promoter i nevroner (inkludert periferien sensoriske nevroner) er godt egnet for de langsgående studier av individuelle nerveender over lengre perioder opptil flere måneder eller til og med livslang. Videre, ved bruk av samme femtosekund laser som for avbildning, er det mulig å produsere meget selektive lesjoner av nervefibre for de studier av nervefiber omstilling. Her presenterer vi en enkel og pålitelig protokoll for langsgående multiphoton in vivo avbildning oglaser-baserte mikrokirurgi på mus huden nerveender.
Introduction
Kutane nerveender gjennomgå dynamiske endringene under forskjellige patofysiologiske tilstander. Nervefibre kan gå gjennom prosessen med degenerasjon og regenerasjon eller restrukturering i løpet av slike sykdommer som perifer neuropati 2 eller Mortons neuroma tre. Etter traumatisk skade, en viktig del av nerve avslutninger dynamikk i huden er reinnervation av det skadede området. Imidlertid er det felles tilnærming for undersøkelse av nerveender ex vivo histologisk seksjonering som mangler sanntidsinformasjon om de pågående prosessene fire. Ved hjelp av genetisk kodede fluorescerende markører, er det mulig å spore de nerveender i huden til levende dyr, for således å oppnå rik og betydelig mer relevant informasjon om strukturendring. Etterforskningen av kutane nerveender er mulig ved hjelp av konvensjonelle fluorescerende mikroskopi, men undergraver den sterke lysspredning av huden vev sterkt kvalitetenav dataene ervervet fem. Multiphoton mikroskopi tillater kjøp av høyoppløselige bilder i sterkt spredning vev på grunn av den ikke-lineære summering av energien eksiteringslys fotoner som resulterer i utslipp av fluorescens bare fra det sentrale punktet i målet. Denne effekten fører til en sterk økning av inntrengningsdybde og forbedring av signal-til-støy-forholdet for måle i hudvevet 6. Ved hjelp av den samme laser som for avbildning, er det mulig å produsere selektiv disseksjon av nervefibre 7. I den følgende protokoll viser vi fremgangsmåte for langsgående avbildning av kutane nerveender in vivo i transgene mus reporter kombinert med selektiv laser lesjon ved hjelp av kommersielt tilgjengelig multiphoton mikroskopsystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette video protokollen demonstrerer vi fremgangsmåten for ikke-invasiv langsgående to-foton avbildning av enkelt-nerveender.
Dynamikken i hud innervations påvirkes i slike sykdommer som psoriasis og perifer neuropati 2, og i traumatiske skader ni. To-foton avbildning tillater detaljert analyse av nervefibrene strukturer i kollagenmatriksen. Bruken av transgene rapportør mus bidrar til å unngå de problemene som angår farging av nervefibrene. Thy1-YFP-H belastni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Neurotar Ltd for teknisk assistanse, CIMO Foundation og FGSN for økonomisk støtte.
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
References
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Wu, K. K. Morton’s interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
- Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
- Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
- Sacconi, L., O’Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
- Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
- Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
- Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).
