Summary

Aislamiento y cultivo de células endoteliales del cerebro anterior embrionarias

Published: January 23, 2014
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Summary

Este video muestra una estrategia fácil y confiable para la preparación de cultivos puros de células endoteliales del cerebro anterior embrionario dentro de 10 a 12 días y será útil para la investigación se centró en muchos aspectos de la angiogénesis cerebral.

Abstract

Células endoteliales cerebrales embrionarias pueden servir como una herramienta importante en el estudio de la angiogénesis y el desarrollo neuro-vascular y las interacciones. Las dos redes vasculares del cerebro anterior embrionario, pial y periventricular, son espacialmente distintivo y tienen diferentes orígenes y patrones de crecimiento. Las células endoteliales de las redes vasculares pial y periventriculares tienen perfiles de expresión de genes únicos y funciones. Aquí se presenta un protocolo paso a paso para el aislamiento, la cultura, y la verificación de las poblaciones puras de células endoteliales de la red vascular periventricular (PVECs) del cerebro anterior embrionario (telencéfalo). En este enfoque, telencéfalo desprovisto de membrana de la pía madre obtenido a partir de día embrionario 15 ratones se pica, se digirió con colagenasa / dispasa, y se dispersa mecánicamente en una suspensión de células individuales. PVECs se purificaron a partir de la suspensión celular utilizando selección positiva con el anticuerpo conjugado con microperlas anti-CD-31/PECAM-1 usando un fuerte magnéticamétodo de separación. Las células purificadas se cultivan en placas de cultivo de colágeno 1 recubiertas en medio de cultivo de células endoteliales hasta que se vuelven confluentes y más subcultivado. PVECs obtiene con este protocolo de adoquines de exposiciones y fenotipos en forma de huso, como se visualiza mediante microscopía óptica de contraste de fases y microscopía de fluorescencia. Pureza de los cultivos PVEC se estableció con marcadores de células endoteliales. En nuestras manos, este método produce de forma fiable y consistente poblaciones puras de PVECs. Este protocolo se beneficiarán los estudios dirigidos a la obtención de conocimientos sobre mecánica en angiogénesis cerebro anterior, la comprensión de las interacciones PVEC y cruzadas las conversaciones con los tipos de células neuronales y tiene un enorme potencial para angiogénesis terapéutica.

Introduction

La angiogénesis, la neurogénesis y la migración neuronal son eventos críticos en el sistema nervioso central (SNC) el desarrollo, la reparación y la regeneración. Varios estudios elegantes han demostrado que las células endoteliales estimula la proliferación neuronal y viceversa a través de la liberación de factores solubles y por contacto directo. Encontramos curioso que en la mayoría de estos estudios 1-3, mientras que progenitoras neuronales células madre neurales / están aislados del cerebro embrionario, que se co-cultivaron con células endoteliales del cerebro adulto, otras fuentes de tejidos adultos, o con líneas de células endoteliales. Esto podría ser en parte debido a las dificultades técnicas asociadas con el aislamiento y el cultivo de poblaciones puras de células endoteliales del cerebro embrionario. Sin embargo, la angiogénesis, la neurogénesis, y la migración neuronal son eventos concurrentes que ocurren en órdenes de magnitud más robusto en el cerebro embrionario que en el cerebro adulto normal. La red vascular periventricular del embryonic cerebro anterior (telencéfalo) se origina a partir de un recipiente situado en el primordio ganglios basales y se desarrolla en la forma de un gradiente ordenada de ventral a dorsal telencéfalo por día embrionario 11 (E11) de 4,5. Este plexo de vasos de la red vascular periventricular son distintos de los buques de pial basada en orígenes, localización anatómica, patrones de crecimiento y regulación del desarrollo 4,5. La dirección de propagación de la pendiente de la angiogénesis periventricular coincide con el gradiente transversal neurogenetic telencephalic. Dentro del telencéfalo, el gradiente de la angiogénesis periventricular y el gradiente de las neuronas GABA que migran tangencialmente superpone espacialmente y 6. Con respecto a la sincronización, el gradiente de la angiogénesis es antes de la pendiente y de la neurona de GABA gradiente neurogenético en aproximadamente un día. Así, las células endoteliales periventriculares son espacial y temporalmente en buena posición para proporcionar señales vitales para ayudar en la neurogénesis y telencephalic4,6 migración neuronal. Por lo tanto, el uso de células endoteliales periventriculares embrionarias en experimentos de cocultivo con células progenitoras y / o neuronas neuronales proporcionaría un modelo más favorable para el estudio de interacciones neurovasculares y el desarrollo de nuevas vías para el tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa o una lesión cerebral isquémica / traumática.

Hacemos hincapié en la importancia de eliminar la membrana pial, no sólo para limitar la contaminación de las células epiteliales, sino también para separar las células endoteliales pial que son molecularmente y funcionalmente distinta de las células endoteliales de la red vascular periventricular 4,6 (PVECs denominados de distinguir de pial EC) . Aquí se describe el método que utilizamos habitualmente en nuestro laboratorio para obtener un rendimiento rica y pura de PVECs. Estas células endoteliales se preparan a partir de prosencéfalos embrionarios aislados a partir de un solo ratón temporizado-embarazada. Se pueden expandir, subcultivaron, y congelaron con éxito para su uso futuro.

Protocol

1. Preparación de los reactivos y soluciones El recubrimiento de 35 mm de placa de cultivo: Colágeno Tipo 1 solución se suministra como una solución acuosa en 20 mM de ácido acético (~ proteína de 100 mg / vial). Diluir un volumen apropiado de solución de colágeno a una concentración de trabajo de 0,01% usando agua de calidad de cultivo de tejido estéril. Platos capa con 1 ml de solución de colágeno durante 3-4 horas a temperatura ambiente (RT) o 37 ° C, o durante la noche a 2-8 º C. Retire el …

Representative Results

La caracterización fenotípica de PVECs de días 1-12 se muestra con contraste de fase microscopía de luz (Figura 2). Las células unidas a la placa en el día 1 muestran la morfología característica de la división celular (Figura 2A). Entre 5-8 días, PVECs transición de la piedra del adoquín de husillo morfología en forma típica de las células endoteliales y más afín a su estado in vivo (Figuras 2B y 2C). Durante el día 12 la cul…

Discussion

De PVEC son fisiológicamente más relevantes de adultos células endoteliales cerebrales y EC de otras fuentes de tejidos para estudios que se centran en las interacciones neurovasculares y también tienen un potencial terapéutico. Para la preparación PVEC, es principio fundamental con la disección que trabajar rápido para lograr una buena viabilidad ya que las células muertas se pueden unir de forma no específica a microperlas CD31. Además, si la suspensión de una sola célula no se consigue antes de la etapa …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una Alianza Nacional para la Investigación sobre la Esquizofrenia y la Depresión (NARSAD) Young Investigator Award y los Institutos Nacionales de Salud de subvención R01NS073635 a AV.

Materials

DNase I Sigma D-4527
Collagen, Type 1 solution from rat tail Sigma C3867
DPBS Quality Biologicals 114057-131
EDTA Fisher Scientific M4055
BSA Sigma A2058
MS column Miltenyi Biotech 130-042-201
CD31 microbeads Miltenyi Biotech 130-097-418
MACS separator Miltenyi Biotech 130-042-102
MACS multi stand Miltenyi Biotech 130-042-303
Cell strainer 70 µm BD Bioscience 352350
Antibiotic and antimycotic solution Sigma A5955
FBS Sigma F4135
Collagenase/Dispase Roche 10269638001
DMEM Lonza 12-604F
35 mm culture dish BD Bioscience 353001
15 ml falcon tube BD Bioscience 352097
50 ml falcon tube BD Bioscience 352098
ECCM kit BD Bioscience 355054 Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Bioscience 354006
RBECGM Cell applications R819-500
DMEM F12 Life Technologies 10565-018
glutamax Life Technologies 305050-061
tissue culture grade water Life Technologies 15230162
0.25% Trypsin Life Technologies 15050
Soyabean trypsin inhibitor BD Bioscience 5425
Matrigel BD Bioscience 354234
Qtracker 655 Cell Labeling Kit Life Technologies Q25021
CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 Life Technologies C10608
Biotinylated Isolectin B4 antibody Sigma L2140
Anti-Von Willebrand factor Sigma F3520
Anti-CD31/PECAM-1 BD Pharmingen 550274
Vectashield Hardset Mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1500
Ketamine Butler Schein Animal Health Supply 44028
Xylazine Lloyd Laboratories 1009
Stereomicroscope Motic SMZ-168
hemocytometer Fisher Scientific 267110
inverted microscope Olympus CK-40 CK-40
Flouroscent microscope Olympus FSX-100 FSX-100
Fine forceps Roboz surgical instrument 7 inox
Fine microtip scissors Roboz surgical instrument RS5611

References

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Cite This Article
Kumar T., P., Vasudevan, A. Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain. J. Vis. Exp. (83), e51021, doi:10.3791/51021 (2014).

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