Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler<em> Streptococcus pneumoniae</em> Floresan boyalar kullanarak

Bizim laboratuvar tümör hücrelerinde apoptoza neden (Tümör hücreleri için öldürücü yapılan insan alfa-laktalbümin için) HAMLET adlandırılan insan sütünden bir protein-lipid kompleksi tespit değil, aynı zamanda bakteri türlerinin ^1,2 çeşitli öldürmek mümkün olduğunu sahiptir. Özellikle duyarlı olduğu bulunmuştur Bu tür büyük hassasiyet ve ölüm ^2,3 bir apoptoz gibi bir fenotip gösteren Streptococcus pneumoniae (pnömokok) ile, solunum yolu hedef olanlar olmuştur. Membran depolarizasyon ve spesifik iyon taşıma etkinlikleri de tarif edilen ve radyoaktif TPP ⁺ iyonları ve JC-1 ve TMRE flüoresan boyalar da dahil olmak üzere, mitokondriyal membran depolarizasyonunu ³ göstermek için kullanılmış olan mitokondri, özellikle ökaryotik hücreler, apoptoz sırasında çok önemli bir etkinlik ^-5. Böylece, biz çabalarımızı odaklı olarak pnömokokkustan bu zar ilgili özellikleri HAMLET etkisi hakkında daha fazla bilgi edinmek için çalıştıbu süreçte yeni antibakteriyel tedavi ya da aşı adaylarını tanımlamak için büyük bir potansiyele sahip bakterilerde apoptosis-benzeri fenotip, mekanistik bileşenlerin daha iyi anlaşılması.

Bizim mekanik çalışmalar için protokolleri kurmak isteyen olarak, ökaryotik sistemlerde de tarif edilen yöntem aksine, bakteriyel ^{zar, 6,7} elektrofizyolojisi ve iyon taşıma mekanizmaları ayrıntılı olarak, çok az sayıda çalışma olduğunu keşfettiler. Bu, esas olarak daha küçük mikroorganizmaların boyutu ve yüzey mimari, dev protoplast kullanarak bazı çalışmalar, karışık başarı ile gösterilmiş olsa da, özellikle hücre çeperinin mevcudiyeti, bu, yama sıkma gibi geleneksel ökaryotik yöntemleri kullanım için zarın erişilebilirlik sınırlayan atfedilir ^8,9. Bu adam gerektirir çünkü bu dev protoplastları ile iş çoğu bakteri türleri için ideal ya da pratik bir yöntem değil gibiipulated bakteri doğal olmayan bir halde ve abiyotik, gerçekleştirilmiştir bakteriyel zarı polarite sınırlı çalışmalar, esas olarak akış sitometrisi kullanılabilir ve siyanin ve oksonol floresan boyaların kullanımı ^10-16.

Tek bir zaman noktasında tek bir bakteriden floresans bir araya gelirler, akış sitometrisi yerine, zaman içinde, 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde bakteriyel süspansiyonlar floresan yoğunluğunu tespit etmek için bir floresans saptama plaka okuyucusu kullanmak tercih etti. Bu çok daha büyük sadeliği ile çeşitli zaman noktalarında bir bakteri nüfusunu ve kolaylığı ve sürekli akım sitometri kullanarak elde etmek zordur, uzun zaman süreleri için tüm nüfusun floresan kinetiği izlemek sağladı. (Mitokondri ile kullanım için yukarıda tarif edilenler de dahil olmak üzere) potansiyel duyarlı fluoresan boyalar geniş bir yelpazede test sonra, kullanarak en iyi teknik ve pratik başarıDiBAC ₄ adı verilen bis-oksonol boya (3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric asit) trimethine oksonol) polariteli değişiklikleri izlemek için.

Ayrıca, bu aynı zamanda değerli propidyum iyodür (PI) ile membranın bütünlüğüne parazitlerin izlemek bulunmuştur. Bu boya nükleik aside bağlanması üzerine fluoresces ama bakteri zarın bütünlüğünün canlı ölü-lekeleme deneylerinde ölü hücreleri tespit etmek için kullanılan bileşen popüler hale tehlikeye zaman bunu yapmak için tek edebilmektedir. PI ek olarak, SYTOX yeşil ve TO-PRO-1 harekete benzerdir ve daha önce tespit yöntemleri ¹⁷ akış sitometrisi kullanılarak birkaç çalışmalarda bakteriler için kullanılmış olan floresan boyalardır. Biz bize nedeniyle verilen bir numunede DiBAC ile eş zamanlı olarak flüoresanını izlemek için izin onun dalgaboyu PI kullanmayı seçti.

Çalışmalarımızda, biz Hamlet'teki, hem de bakteri öldürücü etkinliğe sahip başka bir ilgili protein-lipit kompleksi gözlemledikpnömokok ^3,18,26 tedavisi üzerine hem boyaların floresanstaki artış ile gösterildiği gibi bakteri membranının Eloa indükte depolarizasyon ve kopma olarak da bilinir. Her iki kompleksleri için, DiBAC ₄ florasan yoğunluğu (3) depolarizasyon kopma önce meydana geldiğini gösteren, önceki PI yoğunluğundaki artışa bağlı artış, olduğu görülmektedir Bu nedenle, bakterisidal protein-lipid komplekslerinin neden olduğu bir özel olay faiz. Bu fark, membranın kırılma gibi kendisinin spesifik olmayan depolarizasyonu neden olabilir yapmak için önemlidir. DiBAC ₄ iki ölçüm ve analiz (3) ve PI floresan kinetik eşzamanlı bize fluorometri kullanarak yerine akış sitometri ek bir avantajı, iki zar, olaylar arasındaki bu ilişkiyi incelemek için izin verdi.

Bakteriyel iyon akımına izlemek için, alımını ölçme dahil, radyoizotoplar kullanarak önceki bazı başarı olmuştur45 Ca biz de son yıllarda yapılan çalışmalarda ^{18, 21} kullanmış pnömokokkustan ^{19,20, 2 +.} Bununla birlikte, bu radyoaktif iyonlar ile çalışan birkaç dezavantajları vardır. Bunlar pahalı olabilir, zaman alıcı ve dağınık ve de ilginç izotopu bağlı olarak, zarar deneyi gerçekleştiren bireysel açığa çıkarabilir. Buna ek olarak, zaman içinde hızlı bir değişim gözlem altında tutmak güçtür. Böylece, iyona duyarlı floresan göstergesi boyalar asetoksimetil (AM) ester versiyonları kullanan ölçüm alternatif bir yöntem döndü. Kendi başına, gösterge boya şarj edilir ve kolay bir şekilde membrandan geçmez, fakat lipofilik ester grubunun eklenmesi ile, şimdi yüksüz molekül, bakterinin zar içinden geçebilir. Iç girdikten sonra, bakteriyel esterazlar yüklü daha önemli hücre çıkmak kabiliyetini yavaşlama ve izin boya t hücre içinde serbest bırakarak boya, ester grubunun ayrılması veo zamanla birikebilir. Bununla birlikte, bu ester boyaların kullanımı sadece yükleme, algılama ve başarı çeşitli yöntemlerle, hücre içi ^{Ca2 +} ve H ^{+, 22-24 16} değişiklikleri tespit etmek için bir kaç bakteri türlerinde tanımlanmıştır.

Hücre içi Ca değişiklikleri izlemek için bir arzu ile ^{2 +} ve S. de K ⁺ ve H ⁺ düzeyleri pneumoniae HAMLET ve diğer bileşikler ile işlenmesi üzerine, başarılı etkili bir bakteri hücrelerine floresan göstergesi boyalar yüklemek için protokolleri oluşturulur. Anyon-taşıyıcıları ve PowerLoad, yükleme verimliliğini artırır Life Technologies tescilli bir bileşik engelleyerek boya tutma gücünü arttırır hem probenesit gerekli bakteri içine etkili yükleniyor. (K ⁺ tespit) Fura-2/AM (Ca ^{2 +} algılama), PBFI / AM ve BCECF / AM (H ⁺ algılama) başarıyla kapsüllenmemiş ve kapsüllü hem pnömokok st yüklenmiştirbir floresans saptama plaka okuyucusu ^{18, 21} ile (K ⁺ uncoupler) ve CCCP (H ⁺ uncoupler) valinomycin gibi ionomisin (Ca ^{2 +} uncoupler) ve iyonoforlar, ilave edildikten sonra, elde edilen flüoresan desen ölçümünü sağlayan yağmurlar.