설치류 Neuroblasts의 Nucleofection는 Neuroblast 마이그레이션을 연구하는<em> 체외</em

이 절차는 영국 홈 오피스 규정 (동물 과학적인 절차의 법, 1986)에 따른다. 과학자들은 설립하고 자신의 기관 및 국가 동물 규제 기관에 의해 승인 된 지침을 따라야합니다. 1. 해부 및 쥐 RMS Neuroblasts의 해리 RMS의 해부 및 분리에 필요한 솔루션을 준비 : 해부 배지 (100 ㎖) 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) – 98.5 ML 5 M HEPES pH가 7.4-0.5 ML 페니실린 스트렙토 마이신 (10,000 단위 / ㎖ 10,000 ㎍ / ㎖) – 1 ㎖ 해리 매체 (2 ㎖) HBSS – 1.760 ML 배 트립신 (2.5 %) – 200 μL DNAse1 (1 ㎎ / ㎖) – 40 μL 둘 베코 이글의 중간 (DMEM) + 10 % 소 태아 혈청 (FCS) (40 ㎖)에 수정 DMEM -36 ML FCS – 4 ML 완전 배지 (12 ㎖) Neurobasal 매체 – 11.46 ML B27 보충 – 250 μL L-글루타민 (200 MM) – 125 μL 포도당 (45 %) – 165 μL 2. DMEM + 10 % FCS와 완전한 매체 필터 소독 및 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에서 그들을 preequilibrate. 해부 자궁 전위에 의해 P6-P7 쥐 쓰레기 (약 12 새끼)를 희생하고 가위로 목을 베다. 메스 블레이드와 소뇌에 코의 중간 시상 봉합을 따라 피부에 전후의 절개를합니다. 피부를 벗기고 두개골을 따라 같은 절개를 반복합니다. 부드럽게 집게와 두개골 뚜껑을 제거하고 조심스럽게 후각 전구를 포함하도록주의하면서 주걱으로 두뇌를 제거합니다. 뇌의 가장 꼬리 제를 잘라 버린다. 일을 잘라조직 헬기를 사용하여 1.4 mm 두께의 관상 조각으로 전자 뇌 조직. 차가운 해부 매체를 포함하는 요리 조각을 놓고 조심스럽게 바늘을 사용하여 구분합니다. RMS는 삼각형, OB 구역의 중앙에 더 많은 꼬리 뇌 조각의 작은 원형 영역으로 반투명 영역으로 나타납니다. 주변 조직을 포함하지 않도록주의하면서 미세 수술 칼을 각 조각 중 RMS를 잘라. P7 쥐 새끼에서, 일반적으로 (OB 포함) ~ 8 가장 주동이의 조각은 RMS가 포함되어 있습니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 RMS 조각을 수집하고 얼음에 차가운 해부 매체를 포함하는 작은 접시에 놓습니다. 박리가 완료되면, 플라스틱 피펫으로 15 ㎖의 튜브에 RMS 단편을 전송. 튜브의 바닥에 정착 조각을 남겨주세요. 분리 해리 배지 2 ㎖로 해부 매체를 교체합니다. 부드럽게 P에 의해 RMS 조각을 씹다최대 약 10 배 P1000 피펫을 사용하여 아래로 조각 서스펜션 ipetting. 2 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 조직 파편 튜브를 남겨주세요. 다시 배를 솔루션을 피펫 단편 (서스펜션이 흐려질한다) 해리했는지 확인하십시오. 데워진 DMEM + 10 % FCS 5 ㎖를 추가하여 트립신을 불 활성화. 5 분 동안 433 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 한편 분취에서 에펜 도르프 튜브에의 siRNA / DNA의 필요한 금액 (보통 3-5 μg의 DNA / shRNA를 또는 nucleofection 당 5-9 μg의 siRNA를 올리고 그러나 DNA / siRNA의 양이 최적화가 필요할 수 있습니다.) 초과 매체를 제거하고 데워진 DMEM + 10 % FCS 5 ㎖에 부드러운 피펫으로 세포 펠렛을 resuspend. 셀 카운트를 수행합니다. 쥐 강아지의 뇌 당 ~ 1 × 10 6 세포를 기대합니다. 동안 2.5 × 10 6 세포의 최소 각 nucleofection 필요합니다최적의 결과는 nucleofection 당 3 ~ 4 × 10 6 세포를 사용하여 달성된다. 5 분 동안 433 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 가능한 한 많은 매체를 제거해야합니다. 2. Nucleofection 이전에 실온에서 배양 신경 nucleofection 용액 (마우스 세포를 사용하는 경우 나 마우스) 즉시 래트에서 세포 펠렛을 재현 탁. nucleofection 당 100 μl를 사용하십시오 :. 일반적으로 12 새끼 쥐 쓰레기 4 nucleofections을 수행하기에 충분하며, 마우스 쓰레기 (12 새끼가) 2 nucleofections을 수행하기에 충분하다. siRNA를 / DNA를 포함하는 각 에펜 도르프 튜브에 세포 현탁액 100 μl를 전송하고 P200 피펫과 피펫으로 가볍게 2 – 3 배 혼합. 거품을 방지 해주는 nucleofectioncuvette의 바닥에 샘플 (cell-DNA/siRNA 서스펜션)를 추가합니다. Nucleofect 프로그램 G-013 (쥐 세포)를 사용 또는 O-005 (대한마우스 세포). 한 nucleofection 약 5 초 정도의 시간이 소요됩니다. 빨리 nucleofected 샘플에 데워진 DMEM + 10 % FCS의 1 ML을 추가합니다. 반복 2.4 다른 모든 샘플에 대한 2.5 단계를 반복합니다. 참고 : 최적의 결과를 위해, 전체 nucleofection 과정은 5 분보다 더 이상 지속되어야한다. nucleofection 키트에서 제공하는 플라스틱 피펫을 사용하여 데워진 DMEM + 10 % FCS 5 ㎖를 포함하는 15 ML 튜브에 각각의 샘플을 전송합니다. 튜브에 어떤 세포 파편을 전송하지 마십시오. 5 분 433 XG에 원심 분리기 샘플. 주의 깊게 초과 매체를 제거하고 P20 피펫을 사용하여 데워진 DMEM + 10 % FCS의 25 ~ 30 μL에 펠렛을 재현 탁. 매체의 30 μl를 사용하지 마십시오. P35 접시 뚜껑의 안쪽에 드롭으로 현탁액을 피펫. (그림 1 참조) 완전 배지 2 ㎖를 포함하는 P35의 접시 위에 뚜껑을 반전. 에 대한 (37 ° C / 5 % CO 2) 배양기에서 떠나최대 7 시간에 적어도 5 시간합니다. 긴 배양 시간은 세포 클러스터의 더 나은 재 응집 할 수 있습니다. 컷 팁 P1000 피펫을 사용하여 접시에 완전한 매체에 뚜껑에서 매달려 방울을 전송합니다. DNA의 nucleofections과의 siRNA / shRNA를의 nucleofections 48 시간 동안 24 시간 동안 37 ° C / 5 % CO 2에서 배양한다. 3. 퍼가기 완전 배지 (25 ㎖)을 준비하고 몇 시간 동안 37 ° C / 5 % CO 2에서 그것을 preequilibrate. -80 ° C 냉동고에서 기저막 행렬의 냉동 분량 씩 꺼내 냉장실에서 얼음에 녹여. 각 여덟 13mm 멸균 coverlips까지 포함 6cm 요리를 준비 nucleofection하십시오. 집착 필름으로 덮여 아이스 박스에 음식을 놓습니다. 그것은 매립 절차를 수행하는 동안 매트릭스 응고를 방지하기 위해 멋진 커버 슬립을 유지하는 것이 중요합니다. 습도를 유지하기 위해 15cm 접시 축축한 내부 조직의 스트립을 배치하는 것이 w병이 포함 된 neuroblasts를 포함하는 세 6cm 요리까지 수용 할 수. 1:3 비율로 해동 행렬에 완전 배지를 추가합니다. 예를 들어, 피펫 팅에 의해 행렬의 120 μL로 전체 매체의 40 μl를 섞는다. 행렬의이 금액은 8 ~ 12 밀리의 coverslips에 집계를 포함하기에 충분하다. 15 ML 튜브와 원심 분리기에서에 reaggregated 세포 클러스터로 이동 5 분 433 XG. 초과 매체를 제거하고 완전한 매체의 10 μL에 펠렛을 재현 탁. 각 멸균 커버 슬립에 세포 집계 정지 2 μl를 놓고 매트릭스 / 완전 배지 혼합물의 18 μl를 추가합니다. 전체 커버 슬립을 통해 매트릭스를 확산 피펫 팁을 사용합니다. 즉시 15cm 접시에 커버 슬립을 포함 6cm 접시를 놓고 15 ~ 20 분 (37 ° C / 5 % CO 2) 배양기에서 떠난다. 행렬이 응고 할 때, 부드럽게 밀어 각 6cm 요리 돌보는에 5 ㎖ 완전 배지를 추가피펫 팁과 부동 커버 슬립 다운. neuroblasts가 세포 집합체 밖으로 마이그레이션 할 수 있도록 37 ° C / 5 % CO 2에서 24 시간 동안 배양한다. 4. 3D 마이그레이션 분석 면역 염색에 필요한 솔루션을 준비합니다. 블록 솔루션을 준비 : 염소 블록 용액 (50 ㎖) 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) – 5 ㎖ 염소 혈청 – 12 ML 10 % 트리톤 X-100-1.5 ML BSA – 50 밀리그램 H 2 O – 36 ML 4 ° C에서 필터 및 저장 고정 솔루션을 준비 : (100 ㎖) 솔루션을 고정 파라 포름 알데히드 (PFA) – 4g주의 : 항상 후드 PFA 처리 자당 – 20 G (선택 사양) PBS 최대 100 ML 핫 플레이트에 일정한 교반하면서 80 ㎖에 PFA를 용해 PBS는 65 ℃로 유지 PFA가 용해되면, 자당 20g을 추가합니다. 에 산도를 조정7.4 (통상 용액 100 ㎖ 당 1 ~ 60 ㎕의 M의 NaOH를 첨가함으로써). PBS 100 ML의 총 부피까지 오십시오. 면역 염색 24 – 웰 플레이트에 커버 슬립을 놓습니다. PBS 배와 커버 슬립을 씻어. 실온에서 45 분 동안 고정 솔루션 RMS의 neuroblast 집계를 수정. PBS 배와 커버 슬립 (- 락을 플랫폼에서 5 분 / 워시)를 씻어. 염소 블록 솔루션을 30 ~ 60 분 동안 차단합니다. 염소 블록 솔루션에 기본 항체를 희석하고 4 ℃에서 하룻밤 배양 (원하는 경우, 형광 phalloidin도 (1:400) 및 훽스트 염료 (1:10,000)도 사상 액틴과 핵을 시각화 차 항체 용액에 첨가 될 수있다). PBS 배 (5 분 / 워시)와 커버 슬립을 씻어. 염소 블록 솔루션 차 항체를 희석하고 실온에서 2 시간 동안 배양한다. coversli을 씻어PBS 배와 PS (5 분 / 워시) 마운트 형광 설치 매체의 coverslips 실온에서 하룻밤 건조 둡니다. 마이그레이션 분석 10X 목표를 사용하여 형광 현미경으로 고정 RMS의 neuroblast 집계의 이미지를 캡처합니다. 샘플 이미지의 스케일 바 (가) 있습니다. , 정량의 규모를 설정 ImageJ에 도구 모음의 '직선'도구를 선택하여 이미지의 눈금 막대를 측정합니다. '분석'옵션을 선택하고 '설정 규모'를 클릭합니다. 스케일 창에서 '알려진 거리'를 설정하고 모든 측정에 동일한 설정을 유지하기 위해 '글로벌'상자에 체크. 전체 집계 (그림 3B)의 주위에 6 개의 부문에서 멀리 이주 neuroblast로 집계의 가장자리까지의 거리를 측정하기 위해 ImageJ에 도구 모음의 '분단 선'도구를 사용합니다. 만 고립 AG를 고려분석을 위해 gregates. 각 집계 얻은 6 값의 평균 이동 거리를 계산합니다. 세 개의 독립적 인 실험의 최소으로부터 모든 독립적 인 실험 및 수영장 결과에 각 조건에 대한 10-20 집계를 측정한다. 항상 nucleofection 제어 (예를 들면. GFP 또는 제어 쉬 /의 siRNA) 등이 있습니다.