Une méthode innovante pour Exosome Quantification et Taille Mesure
Summary
A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Abstract
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Introduction
La fonction exacte des exosomes circulant restée inconnue pendant une longue période de temps. Même maintenant le mécanisme de chemin d'accès complet des exosomes est pas entièrement comprise. Depuis exosomes portent des antigènes, des protéines et de l'ARN (ARNm et des miRNA) qui les concerne leur cellule d'origine des parents, leur fonction de cellule-cellule émetteurs de signalisation a essentiellement été donné la priorité.
De nombreux procédés différents ont été décrits dans la littérature pour l'isolement et la détection quantitative d'exosomes 1,2. Toutefois, aucun consensus sur une «norme d'or» a été atteint. Pendant ce temps la majorité des scientifiques actifs dans le domaine de la recherche exosomes conviennent qu'une méthode cohérente de l'isolement est fortement justifiée pour atteindre un plus haut degré de comparabilité entre les différents rapports et études.
Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) est l'outil le plus commun et répandu pour l'analyse des exosomes 3. FACS a benEFIT que, par marquage par fluorescence, des cellules d'origines différentes peuvent être comparés à une étape. Les inconvénients majeurs de FACS sont que cette méthode ne est pas assez sensible pour identifier les particules inférieures à 0,5 pm 4, tandis que les exosomes sont généralement comprises entre 30 à 120 nm de diamètre 5, encore moins de mesurer leur taille.
La microscopie électronique à balayage (MEB) et microscopie électronique à transmission (MET) d'autres outils d'analyse de taille de particule et la morphologie des exosomes. Toutefois, les deux SEM et TEM ont l'inconvénient que la préparation des échantillons est beaucoup de temps, les deux méthodes impliquent étapes de main-d'œuvre et chacun a un risque de génération artefact. Ni méthode est adaptée pour un débit d'échantillonnage élevée et la caractérisation de plusieurs milliers de particules individuelles d'un échantillon. En outre, une analyse quantitative de routine quotidienne clinique où les échantillons doivent souvent être analysé simultanément ou au moins dans une très courte période estdifficile à réaliser. De nouvelles techniques de production nous permettent maintenant d'analyser exosomes sans travaux préparatoires intensifs avant (SEM par exemple, de l'environnement). Ces techniques modernes sont encore assez gênant pour l'analyse de grandes suspensions de volume contenant exosomes afin de déterminer leur nombre moyen et la distribution de la taille 6.
Une autre méthode très sensible pour la visualisation et l'analyse des exosomes est l'analyse de nanoparticules de suivi (NTA). Cette méthode tire parti de deux principes différents de la physique. Tout d'abord, des particules sont détectées par la lumière diffusée quand ils sont irradiés avec un faisceau laser. Le second phénomène est appelé mouvement brownien, selon lequel la diffusion des différentes particules dans une suspension liquide est inversement proportionnelle à leur taille. Dans ce dernier cas, le mouvement dépend aussi de la température et de la viscosité du liquide. Cependant, ce taux est directement liée à la taille des particules et est utilisé par NTA. Utilisation douceanalyse basée-ware, des images numériques de la lumière diffusée par les particules simples sont enregistrées. Lots de taches lumineuses dispersées et leur vitesse de déplacement fournissent des données qui facilitent la détermination du nombre total des particules et la distribution granulométrique. Cette technique est particulièrement puissant pour l'analyse des particules d'un diamètre moyen inférieur à 100 nm.
Taille et la concentration Les mesures sont effectuées avec le ZETAview brownien et Microscope Analyse électrophorèse Video Motion. Il se agit d'un dessus de bureau nanoparticule instrument d'analyse semi-automatique pour échantillons liquides (ci-après dénommé instrument de suivi des particules). Il se compose du suivi analyseur de particules ainsi que d'un ordinateur portable avec le logiciel utilisé pour l'analyse de données. Des échantillons biologiques hétérogènes sont comme convenant à ce procédé sous forme de suspensions homogènes de plus des particules inorganiques. Microscope de diffraction laser à l'aide d'une caméra vidéo est utilisée pour la détection de particules et de la observation de leur mouvement. Bien que l'axe de microscope est horizontal et centré dans le canal de cellule remplie d'une suspension contenant des exosomes, le faisceau laser est orienté verticalement. Les particules irradiés par la dispersion de la lumière laser, qui est enregistré sous 90 ° par une caméra vidéo numérique via le microscope (Figure 1). L'intensité de la lumière diffusée permet l'observation de particules de plus grand diamètre de 60 nm. Dans un tel réglage de la luminosité d'une particule ne est pas la seule indication de la taille des particules. Si aucun champ électrique est appliqué, le mouvement des particules ne suit le mouvement brownien et peut servir d'indicateur pour le calcul de la taille des particules. Cependant, l'appareil est également capable d'appliquer un champ électrique à travers le canal de la cellule. Lorsque soumis à ce champ, le potentiel, la polarité et le niveau de charge ionique des exosomes suspendus deviennent d'autres déterminants de la direction de leur mouvement. Velocity et le résultat de direction dans un mo électrophorétiquebilité histogramme.
Bien que la recherche d'une méthode optimale pour analyser exosomes isolés ya un problème, un autre se trouve dans l'isolement d'exosomes efficace de différents supports, tels que le sang, l'ascite, l'urine, le lait, le liquide amniotique ou le support de la cellule. Différentes méthodes ont été décrites à ce jour, qui sont basées sur une ultracentrifugation, réactifs de séparation industriels (tels que Exoquick) 7, des billes magnétiques pour antigène employant séparation 8 ou 9 étapes ultrafiltration.
Dans ce protocole, nous démontrons l'ensemble du processus d'isolement de exosomes par ultracentrifugation et montrons comment analyser l'exosomes résultant contenant la suspension par l'intermédiaire de l'instrument de suivi de particules. Considérations particulières relatives à l'analyse des exosomes dérivés de plasma moyennes ou de la culture de cellules humaines sont fournis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous démontrons un protocole détaillé pour l'isolement exosomes du sang et du présent suivi de nanoparticules comme une méthode nouvelle et novatrice pour mesurer la taille et la concentration de exosomes dans un fluide biologique. Dans les expériences présentées sang périphérique humain a été utilisé comme origine des exosomes. Cependant, d'autres origines, tels que l'urine, le crachat, le surnageant de culture cellulaire, etc., peuvent également être utilisées comme matériau d'essai.
Basé sur la variabilité biologique de concentration exosomes chez les humains, les tests de différents individus peuvent présenter une concentration remarquable variable des exosomes. Cependant, la concentration de particules dans la sonde d'essai biologique peut avoir un impact sur les résultats. Par conséquent, une approche fiable et normalisée de la dilution de sondes est nécessaire. Dans la méthode présentée exosomes contenant le plasma a été généré à partir de 9 ml de sang total périphérique. Par centrifugation différentielle étapes d'une boulette de exosome été isolé à partir1 ml de plasma et remis en suspension dans 5 ml d'eau distillée à entraîner dans l'échantillon de travail des exosomes suspension. Ce paramètre de pré-défini nous a fourni avec une bonne concentration de particules, ce est à dire, l'intensité de dispersion approprié pendant NTA. En plus de l'aspect et du volume de dilution, la composition des solutions utilisées est également importante. Nous avons utilisé de l'eau distillée pour la remise en suspension définitive des exosomes. Bien entendu, différents supports pour l'étape de dilution finale peuvent également être utilisées, selon les exigences du montage expérimental. Toutefois, dans le cas de mesures du potentiel zêta de ioniques-solutions, en particulier lors de l'essai des échantillons d'une capacité de tamponnage, une dilution prudent dans des conditions libres de turbulence est utile. Pour la comparaison directe de plusieurs échantillons, nous recommandons de conserver le même niveau de dilution pour tous les échantillons. Tous les réglages, sauf la sensibilité et la résolution vidéo peuvent être modifiés par la suite en utilisant le logiciel d'analyse ZETAview.
<p class="Jove_content"> Bien que les auteurs estiment que le système mis en place de la présente représente actuellement l'instrument le plus approprié, il ne est pas le seul système disponible NTA. Un certain nombre de rapports précédents ont employé d'autres systèmes qui se appliquent les mêmes principes NTA mais fournissent une autre conception de l'instrument qui va de pair avec quelques fonctionnalités différentes 10. Nous pensons que les aspects pratiques concernant la manipulation des échantillons et la reproductibilité des résultats sont d'une importance capitale dans le choix de la séquence méthodologique pour l'évaluation de exosomes. Nous pensons également qu'un système de détection idéal devrait éliminer les facteurs selon l'utilisateur qui peuvent interférer avec les résultats des mesures. L'approche d'analyse de exosomes qui est présentée ici répond au critère de la manipulation facile à un haut degré. Comme autre avantage, l'analyse semi-automatisée des échantillons est réalisée dans un procédé rapide, générant des résultats dans un court laps de temps. Une visualisation en ligne des exosomes facilite l'analyseur à gadans une idée instantanée des caractéristiques d'exosomes, par exemple, la concentration brute.Un ajout très simple et élégante à la technique de mesure présenté ici est l'utilisation d'anticorps marqué et la capture des exosomes du faisceau laser dispersé en utilisant un filtre précédent devant le détecteur. De cette façon sous-populations d'exosomes peuvent être distingués en fonction de leurs antigènes de surface et autres caractéristiques biologiquement pertinentes qui sont techniquement accessible à un coloration fluorescente sélective.
Un inconvénient de la version actuelle de notre instrument de suivi des particules est le fait que, à des niveaux de sensibilité très élevée, tels que des artefacts de bruit de fond peuvent être présents, qui se appuie sur la paroi du canal de la cellule. Une solution technique et l'amélioration du système actuel pourraient être disponibles dans un proche avenir. Par ce procédé, les réflexions de la lumière de dispersion laser sur la paroi du canal est réduit, augmentant ainsi la précision des signaux de mesure et des données obtenues et de l'abaissement de la limite de détection.
Bien que le protocole actuellement utilisé pour l'isolation des exosomes est bien établi et l'instrument de suivi de particules appliqué a une résolution remarquablement précis avec une distribution de taille inférieure de 30 nm, il ne ya aucune garantie que les particules détectées sont en effet tout à fait vrai exosomes. D'autres particules, telles que des fragments de cellules mortes ou des complexes protéiques plus grands peuvent également être présents dans la suspension d'exosomes et conduire à des signaux faux positifs. Une méthode fiable par laquelle cette «pollution» peut être exclue peut être microscopie électronique (ME), soit de transmission EM EM ou balayage. Malheureusement, aucun marqueur général et spécifique pour exosomes a été identifié à ce jour, bien qu'un certain nombre de marqueurs de surface proposées précédemment ont gagné une quantité croissante de l'attention, y compris tétraspanine (Tspan), CD81, C63, CD9, etc. 11.
"> Indépendamment de l'évolution future de la recherche sur les exosomes biologie, notamment en matière de marqueurs spécifiques d'exosomes, le protocole qui est présentée ici fournira une méthode puissante pour l'isolement et la détection des exosomes. Concentration et la taille peuvent être facilement déterminées dans un logiciel assistée manière directe. L'ajout de marqueurs fluorescents sélectifs ou des anticorps fluorophores couplé seront probablement améliorer encore les applications possibles de l'approche présentée de NTA.Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Materials
| Name of the Reagent | |||
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
| Material Name | |||
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
References
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
- Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. , e3037 (2012).
- Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
- Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
- Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
- Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
