Um método inovador para exossomo Quantificação e Size Measurement
Summary
A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Abstract
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Introduction
A função exata de exossomos circulam permaneceu desconhecido por um longo período de tempo. Mesmo se agora o mecanismo de caminho completo de exossomas não é totalmente compreendido. Desde exossomas transportar antigénios, proteínas e ARN (ARNm e miARN) que lhes diz respeito a sua célula de origem parental, a sua função como transmissores de sinalização célula-célula, principalmente, foi dada prioridade.
Muitos métodos diferentes têm sido descritas na literatura para o isolamento e detecção quantitativa de exossomas 1,2. No entanto, não há consenso sobre um "padrão ouro" foi atingido. Enquanto isso, a maioria dos cientistas que operam no domínio da investigação exosome concordam que um método consistente de isolamento é altamente garantido para alcançar um maior grau de comparabilidade entre os diferentes relatórios e estudos.
Fluorescência ativado separação de células (FACS) é a ferramenta mais comum e prevalente para análise exosome 3. FACS tem o benciar que, através de marcação por fluorescência, as células de diferentes origens pode ser comparado, em um passo. As principais desvantagens da FACS são de que este método não é sensível o suficiente para identificar as partículas menores que 0,5 mm 4, enquanto que exossomos são geralmente entre 30-120 nm de diâmetro 5, ainda menos para medir o seu tamanho.
Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) são outras ferramentas para a análise do tamanho das partículas e morfologia de exossomos. No entanto, tanto SEM e TEM tem a desvantagem de que a preparação de amostras é, ambos os métodos envolvem passos de trabalho intensivo, consumidores de tempo e cada um tem um certo risco de geração artefato. Nenhum método é apropriado para elevado débito de amostras e caracterização de vários milhares de partículas individuais de uma amostra. Além disso, uma análise quantitativa para a rotina clínica diária, onde as amostras têm muitas vezes de ser analisadas simultaneamente, ou pelo menos em um período muito curto édifícil de executar. Novas técnicas de geração de agora nos permitem analisar exosomes sem intenso trabalho preparatório antes (SEM por exemplo, ambiental). Estas técnicas modernas ainda são bastante inconveniente para análise de grandes volumes contendo suspensões exosomes para determinar o seu número médio e distribuição de tamanho 6.
Outro método altamente sensível para a visualização e análise de exossomos é de rastreamento de nanopartículas análise (NTA). Este método leva vantagem de dois princípios diferentes da física. Em primeiro lugar, as partículas são detectados pela luz dispersa quando são irradiados com um feixe de laser. O segundo fenómeno é conhecido como movimento Browniano, segundo a qual a difusão de partículas diferentes em uma suspensão líquida é inversamente proporcional ao seu tamanho. Neste último caso, o movimento também depende da temperatura e da viscosidade do líquido. No entanto, esta taxa está diretamente relacionada ao tamanho das partículas e é usado por NTA. Usando suaveanálise baseada-ware, imagens digitais de luz difusa de partículas individuais são gravadas. A parcela de manchas de luz difusa e a sua velocidade de movimento fornecer os dados que facilitar a determinação da contagem total de partículas e distribuição de tamanho. Esta técnica é particularmente poderosa para a análise de partículas com um diâmetro médio de menos de 100 nm.
As medidas de tamanho e concentração são realizadas com o ZetaView browniano e Microscópio Análise Eletroforese de vídeo de animação. Este é um desk top nanopartícula instrumento de análise semi-automatizado para amostras líquidas (doravante referida como o instrumento de rastreamento de partículas). Consiste no analisador de partículas de rastreamento, bem como um computador portátil com o software utilizado para a análise de dados. Amostras biológicas heterogéneos são tão adequados para este método como suspensões mais homogéneos de partículas inorgânicas. Um microscópio de dispersão a laser com uma câmara de vídeo é usado para a detecção de partículas e para a OBSErvação de seu movimento. Enquanto o eixo horizontal e microscópio é focada dentro do canal celular preenchido com uma suspensão contendo exossomas, o feixe de laser é orientado verticalmente. As partículas irradiadas pela dispersão de laser a luz, que é contabilizada em 90 ° por uma câmera de vídeo digital através do microscópio (Figura 1). A intensidade da luz dispersa permite a observação de partículas superiores a 60 nm de diâmetro. Numa tal configuração do brilho de uma partícula não é a única indicação de tamanho de partícula. Quando nenhum campo elétrico é aplicado, o movimento de partículas só segue o movimento browniano e pode servir como um indicador para o cálculo do tamanho das partículas. No entanto, o instrumento também é capaz de aplicar um campo eléctrico através do canal celular. Quando submetido a este campo, o potencial, polaridade e nível de carga iônicos dos exossomos suspensas se tornarem outros determinantes da direção de seu movimento. Velocidade e direção resultado em um mo eletroforéticahistograma dade.
Enquanto encontrar um método ideal para analisar exossomas isoladas é um problema, um outro está no isolamento eficaz de exossomas a partir de diferentes meios, tais como sangue, ascites, urina, leite, fluido amniótico ou meio celular. Diferentes métodos têm sido descrita até agora, que são baseados em ultracentrifugação 1, reagentes de separação industriais (como Exoquick 7), esferas magnéticas para antigénio empregando separação 8 ou 9 passos de ultrafiltração.
Neste protocolo, demonstrar todo o processo de isolamento exosome via ultracentrifugação e mostrar como analisar a exosome resultante contendo suspensão através de um instrumento de rastreamento de partículas. As considerações específicas para a análise de médias no plasma ou cultura de células humanas exossomas derivados são fornecidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós demonstramos um protocolo detalhado para o isolamento de exossomas a partir do sangue e de seguimento de nanopartículas presentes como um método novo e inovador para medir o tamanho de exossoma e concentração num fluido biológico. Nas experiências apresentadas no sangue periférico humano foi utilizado como a origem dos exossomas. No entanto, outras origens, tais como urina, expectoração, o sobrenadante da cultura de células, etc, também podem ser utilizados como material de teste.
Com base na variabilidade biológica de concentração de exossoma em seres humanos, os ensaios de diferentes indivíduos podem apresentar uma concentração variando notavelmente de exossomas. No entanto, a concentração de partículas na ponta de prova biológica pode ter um impacto sobre os resultados. Portanto, é necessária uma abordagem confiável e padronizada para a diluição de sondas. No método apresentado exossomas contendo plasma foi gerado a partir de 9 ml de sangue total periférico. Utilizando centrifugação diferencial, os passos de uma pelota foi isolado a partir de exossoma1 ml de plasma e re-suspensos em 5 ml de água destilada para provocar a amostra de trabalho de exossomas suspensos. Essa configuração pré-definida nos proporcionou uma concentração adequada de partículas, ou seja, a intensidade de dispersão adequada durante NTA. Ao lado do volume e diluição aspecto, a composição das soluções que são usadas também é de importância. Temos utilizado água destilada para a re-suspensão final de exossomos. Naturalmente, também podem ser utilizados diferentes meios de comunicação para o passo final de diluição, de acordo com os requisitos da instalação experimental. No entanto, no caso de medições de potencial zeta de soluções-iónicos, particularmente no caso dos ensaios de amostras com uma capacidade de tamponamento, uma diluição prudente em condições livres de turbulência é útil. Para a comparação direta de várias amostras recomendamos manter o mesmo nível de diluição para todas as amostras. Todas as configurações, exceto a sensibilidade e resolução de vídeo pode ser alterado mais tarde, utilizando o software Análise ZetaView.
<p class="Jove_content"> Embora os autores acreditam que o sistema introduzido aqui representa atualmente o instrumento mais adequado, não é o único sistema disponível NTA. Uma série de relatórios anteriores empregaram outros sistemas que se aplicam os mesmos princípios NTA mas fornecem um outro projeto instrumento que vai junto com algumas características diferentes 10. Acreditamos que os aspectos práticos relativos à manipulação da amostra e reprodutibilidade dos resultados são de importância central na escolha da seqüência metodológica para avaliação exosome. Acreditamos também que um sistema de detecção ideal deve eliminar fatores dependendo do usuário que podem interferir com os resultados das medições. A análise abordagem exosome que é aqui apresentado cumpre o critério de fácil manuseio para um alto grau. Como uma vantagem adicional, a análise semi-automatizada de amostras é realizada em um processo rápido, a geração de resultados em um curto período de tempo. Uma visualização online de exossomos auxilia o analisador para gaem uma ideia imediata do exossoma características, por exemplo, a concentração bruta.Uma adição muito simples e elegante para a técnica de medição aqui apresentada é a utilização de anticorpos etiquetados e a captura de exossomas de o feixe de laser dispersa usando um filtro anterior em frente do detector. Desta forma, as subpopulações de exossoma podem ser diferenciados de acordo com seus antígenos de superfície e outras características biologicamente relevantes que são tecnicamente acessíveis a uma coloração fluorescente seletivo.
Uma desvantagem das actuais versões do nosso instrumento de rastreamento de partículas é o facto de que em níveis muito elevados de sensibilidade artefactos, tais como o ruído de fundo pode tornar-se presente, que se baseia na parede do canal celular. A solução técnica e melhoria para o sistema atual pode se tornar disponível em um futuro próximo. Por este método reflexões da dispersão de luz laser sobre a parede do canal será reduzida, aumentando assim a precisão dos sinais medidos e os dados obtidos e a redução do limite de detecção.
Embora o protocolo usado atualmente para o isolamento exosome está bem estabelecida e o instrumento de rastreamento de partículas aplicada tem uma resolução extremamente precisa, com uma distribuição de tamanho menor de 30 nm, não há garantia de que as partículas detectadas são de fato inteiramente verdade exossomos. Outras partículas, tais como fragmentos de células mortas ou complexos proteicos maiores também podem estar presentes na suspensão exossoma e levar a sinais positivos falsos. Um método confiável pelo qual essa "poluição" pode ser excluído pode ser microscopia eletrônica (ME), quer EM transmissão ou EM digitalização. Infelizmente, nenhum marcador específico e geral para exossomos foi identificado até o momento, embora um número de marcadores de superfície anteriormente propostos ganharam uma quantidade crescente de atenção, incluindo tetraspanina (tspan), CD81, C63, CD9, etc. 11.
"> Independentemente do futuro progresso da investigação em biologia exosoma, nomeadamente no que respeita a marcadores específicos de exossoma, o protocolo que é aqui apresentado proporcionará um método poderoso para o isolamento e detecção de exossomas. A concentração e tamanho pode ser facilmente determinada num assistido software forma simples. A adição de marcadores fluorescentes seletivos ou anticorpos fluoróforo acoplado provavelmente irá aumentar ainda mais as possíveis aplicações da abordagem apresentada de NTA.Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Materials
| Name of the Reagent | |||
| Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
| Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
| Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
| Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
| Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
| Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
| Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
| Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
| Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
| Material Name | |||
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |
References
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