JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

V3 Vlekvrije workflow voor een praktische, handige en betrouwbare totale eiwitbelastingscontrole in Western Blotting

Published: December 30, 2013
doi:
10.3791/50948
, , , ,
1Bio-Rad Laboratories

Summary

V3 workflow is een westerse vlek procedure met behulp van vlekvrije gels. De vlekvrije technologie stelt onderzoekers in staat om de kwaliteit van eiwitscheiding te visualiseren, de overdrachtsefficiëntie te verifiëren en vooral om de verandering in het eiwit van belang te valideren met behulp van totale eiwitkwantificering als een betrouwbare belastingscontrole.

Abstract

De westerse vlek is een zeer nuttige en wijdverbreide laboratoriumtechniek, maar de uitvoering ervan is uitdagend. De workflow wordt vaak gekenmerkt als een “black box” omdat een experimentalist niet weet of het met succes is uitgevoerd tot de laatste van verschillende stappen. Bovendien wordt de kwaliteit van westerse vlekgegevens soms uitgedaagd vanwege een gebrek aan effectieve kwaliteitscontroletools in het hele westerse blotting-proces. Hier beschrijven we de V3-westerse workflow, die vlekvrije technologie toepast om de belangrijkste problemen in verband met het traditionele westerse vlekprotocol aan te pakken. Deze workflow stelt onderzoekers in staat: 1) om een gel in ongeveer 20-30 minuten uit te voeren; 2) om steekproefscheidingskwaliteit binnen 5 min na de gelloop te visualiseren; 3) om eiwitten over te brengen in 3-10 min; 4) om de overdrachtsefficiëntie kwantitatief te verifiëren; en vooral 5) om veranderingen in het niveau van het eiwit van belang te valideren met behulp van totale eiwitbelastingscontrole. Deze nieuwe aanpak elimineert de noodzaak van het strippen en opnieuw berispen van de vlek voor huishoudelijke eiwitten zoals β-actine, β-tubuline, GAPDH, enz. De V3-vlekvrije workflow maakt het westerse vlekproces sneller, transparanter, kwantitatiever en betrouwbaarder.

Introduction

Western vlek is een zeer nuttige techniek9, maar er zijn twee grote uitdagingen met western blotting: lang en arbeidsintensief proces en kwaliteit van gegevens. Een traditioneel protocol vereist ongeveer 2 dagen. Het omvat vele stappen, waaronder monstervoorbereiding, gelgieten, eiwitelektroforese en overdracht, membraanblokkering gevolgd door antilichaam incubatie, beeldvorming en heel vaak strippen, reprobing en ten slotte gegevensanalyse. Gedurende dit hele proces zijn er geen betrouwbare en flexibele tools voor procesbesturing. Als zodanig kunnen fouten bij elke stap worden geïntroduceerd en deze fouten kunnen gegevensartefacten genereren; daarom zijn beladingscontroles essentieel bij western blotting om de fouten te identificeren en te corrigeren. De beladingscontrole wordt meestal uitgevoerd door het eiwitniveau van een referentie-eiwit in elk monster te controleren om te zien of het gelijk wordt gepresenteerd. Mensen gebruiken vaak huishoudelijke eiwitten, zoals β-actine, β-tubuline, GAPDH, als beladingscontrole.

De kwaliteit van westerse vlekgegevens is afhankelijk van betrouwbare beladingscontrole. Maar er zijn twee legitieme zorgen bij het gebruik van huishoudelijke eiwitten voor belastingscontroles: 1) de op antilichamen gebaseerde immunodetection van de huishoudelijke eiwitbanden is vaak verzadigd en daarom kan men de belastingsverschillen tussen de monsters niet onderscheiden30; 2) het niveau van de huishoudingeiwitexpressie kan in de steekproeven onder bepaalde experimentele voorwaarden variëren, bijvoorbeeld siRNA behandeling, celdood, celdifferentiatie, enz.11,28,3,6,10,21. Vanwege deze zorgen eisen wetenschappelijke tijdschriften nu dat “voor kwantitatieve vergelijkingen geschikte reagentia, controles en beeldvormingsmethoden met lineaire signaalbereiken moeten worden gebruikt” (Natuurrichtlijn). Evenzo vragen redacteuren van het Journal of Clinical Investigation om betrouwbaardere beladingscontroles24. Om deze redenen moet een huishoudelijk eiwit worden gevalideerd om te kunnen worden gebruikt als beladingscontrole. Ten eerste moet men ervoor zorgen dat het wordt gemeten in het lineaire dynamische bereik van de immunodetectionmethode14,29. Ten tweede moet men ervoor zorgen dat het consistent wordt uitgedrukt in alle monsters26,31,25,19,20.

Een alternatieve oplossing voor een betrouwbare beladingsregeling is het gebruik van totale eiwitmeting van de vlek. Sommige onderzoekers hebben de vlekken gekleurd met totale eiwitvlekken, zoals Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S en vlekvrije technologie, om het totale eiwitsignaal in elke rijstrook te meten als beladingscontrole16,20,13,27,1,4,12. De totale eiwitbelastingscontrole vermijdt de valkuilen die gepaard gaan met huishoudelijke eiwitten. Ten eerste is het een echte weerspiegeling van de hoeveelheid eiwit die voor elk monster wordt geladen. Ten tweede vertoont de totale eiwitvlek een uitstekend lineair dynamisch bereik in het gemeenschappelijke laadbereik voor westerse vlekanalyse (10-50 μg eiwit van een complex cellysaat) en onderscheidt nauwkeurig het belastingsverschil tussen de monsters12.

Vlekvrije technologie is een nieuwe totale eiwitkleuringsmethode waarbij een unieke verbinding wordt gemengd in acrylamidegeloplossing en gelijkmatig wordt verdeeld in de gegoten gel. Nadat elektroforese is voltooid, wordt de gel minimaal 1 minuut blootgesteld aan UV-licht, zodat de vlekverbinding reageert met de tryptofaanresten in het eiwit. De eiwitten worden prikkelbaar onder UV-licht om een sterk fluorescerend signaal te geven dat kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd in een vlekvrije beeldschrijver zoals het ChemiDoc MP-systeem. De vlekvrije verbinding zelf absorbeert echter geen UV-licht, wat resulteert in een lage achtergrond van het gelbeeld. De modificatie van de tryptofaanresten is onomkeerbaar en eiwitten kunnen niet alleen in de gel worden gevisualiseerd, maar ook op de vlek op elk moment na eiwitoverdracht.

De vlekvrije technologie wordt toegepast in de V3 Western Workflow (figuur 1) om de belangrijkste klachten over de traditionele workflow aan te pakken, met name de zorgen over het gebruik van huishoudelijke eiwitten als beladingscontrole. Met behulp van deze workflow kan men: 1) een gel uitvoeren in ongeveer 20-30 minuten, 2) de integriteit van het monster en de kwaliteit van de eiwitscheiding controleren in 5 minuten na het lopen van de gel; 3) breng eiwitten over in 3-10 min; 4) controleer de overdrachtsefficiëntie kwantitatief; en 5) het belangrijkste, valideer veranderingen in het niveau van het eiwit van belang met behulp van totale eiwitbelastingscontrole.

Protocol

1. Eiwit monster prep (Een typische procedure om eiwitten uit celkweek te extraheren wordt beschreven) Plaats de HeLa celkweekschaal in ijs en was de cellen met ijskoude Tris-gebufferde Zoutoplossing (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl). Aspireer de TBS en voeg vervolgens 1 ml per 100 mm schaal ijskoude RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS) aangevuld met fosfatase- en proteaseremmers toe. Schraap aanhechtingscellen van de schaal met behulp van een koude plastic celschraper; breng de celsuspensie voorzichtig over in een voorgekoelde microcentrifugebuis. Houd de constante agitatie gedurende 30 minuten bij 4 °C op een rotator. Draai bij 16.000 x g gedurende 20 min in een voorgekoelde centrifuge van 4 °C. Haal de buis voorzichtig uit de centrifuge en leg deze op ijs. Breng het supernatant over in een verse buis die op ijs wordt bewaard en gooi de pellet weg. Verwijder een klein volume (10-20 μl) lysaat om een eiwittest uit te voeren. Bepaal de eiwitconcentratie voor elk monster met behulp van de RC DC-testkit. Indien nodig, aliquot de eiwitmonsters voor langdurige opslag bij -20 °C. Herhaal bevriezings- en dooicycli veroorzaken eiwitafbraak en moeten worden vermeden. Neem ongeveer 20 μg van elk monster, voeg een gelijk volume van 2x Laemmli Sample Buffer toe (4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0,004% bromofenolblauw, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8). Verwarm elke cellysaat in de monsterbuffer bij 95 °C gedurende 5 min. Centrifugeer 16.000 x g in een microcentrifuge gedurende 1 min. 2. Gel elektroforese met vlekvrije gels (~ 30 min) Neem een Criterion TGX Elke KD-vlekvrije prefabgel (een gel in midi-formaat), verwijder de kam en de tape van de onderkant van de cassette. Plaats de cassette in de Criterion-cel en vul de geïntegreerde bovenste bufferkamer met een loopbuffer van 60 ml (25 mM Tris, 190 mM glycine, 0,1% SDS, pH 8,3). Spoel de putten af met een loopbuffer. Vul elke helft van de onderste buffertank met 400 ml lopende buffer tot de gemarkeerde vullijn. Laad de eiwitmonsters en de juiste eiwitmarkers. Plaats het deksel op de tank en lijn de kleurgecodeerde banaanstekkers uit met bijbehorende vijzels op het deksel. Laat de gel ~30 min op 200 V of 20 min op 300 V. 3. Vlekvrije gelbeeldvorming met behulp van het Chemidoc MP-systeem om de eiwitscheidingskwaliteit te controleren (~ 5 min) Verwijder de gelcassette uit de cel. Gebruik het gereedschap voor het openen van de gelcassette in het deksel van de criterioncel om de cassette open te breken en de gel los te laten. Breng een paar milliliter water aan op het midden van de UV-monsterlade van de ChemiDoc MP-imager. Til de gel voorzichtig uit de cassette en leg deze op de lade. Start Image Lab-software en leg de vlekvrije gelafbeelding (figuur 1A) vast met de volgende instellingen:Toepassing: vlekvrije gelGel activeringstijd: 1 minBeeldvormingsgebied: criteriumgelBelichtingstijd van het beeld: automatisch geoptimaliseerd voor de meest intense banden Haal de gel uit de monsterlade en ga onmiddellijk verder met het overbrengen van de stap. 4. Eiwitoverdracht met het Trans-Blot Turbo-systeem (~ 10 min) Open een Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Pack; plaats de onderste stapel (inclusief het membraan) op de basis van de transfercassette. Plaats de gel op het membraan, plaats de bovenste stapel op de gel en rol bubbels uit. Plaats het deksel op de cassettevoet en draai aan de draaiknop om deze te vergrendelen. Plaats de cassette in de blotter bay. Start de overdracht door een vooraf ingesteld Turbo-programma te selecteren en de criterion-gelgrootte (midi) te kiezen en druk vervolgens op RUN. Een typische run duurt slechts 7 minuten. Wanneer de overdracht voorbij is, demonteer de vloeiende sandwich en plaats zowel de vlek als de gel in een container met gedeioneerd water. 5. Vlekvrije gel- en vlekbeeldvorming met behulp van het Chemidoc MP-systeem om de efficiëntie en kwaliteit van eiwitoverdracht te controleren (~ 5 min) Plaats de gel na de overdracht op de monsterlade van de ChemiDoc MP-imager. Start Image Lab-software en leg de vlekvrije afbeelding van de gel na overdracht (figuur 1B) vast met de volgende instellingen:Toepassing: vlekvrije gelGel activeringstijd: geenBeeldvormingsgebied: criteriumgelBelichtingstijd van het beeld: hetzelfde als de belichtingstijd voor het pretransfergelbeeld Verwijder de gel uit de monsterlade en geef vervolgens de vlek (afbeelding 1C) met de volgende instellingen. Houd de vlek nat met een paar druppels water of TBST bij beeldvorming.Toepassing: vlekvrije vlekBeeldvormingsgebied: criteriumgelBelichtingstijd van het beeld: automatisch geoptimaliseerd voor de meest intense banden Verwijder het vloeimembraan uit de monsterlade en plaats het in een container met TBST (0,1% Tween 20 in TBS). 6. Antilichaam incubatie Blokkeer door de vlek in een oplossing van 3% runderserumalbumine (BSA) in TBST te plaatsen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Incubeer de vlek ‘s nachts bij 4 °C in de oplossing die primair muisantilichaam bevat dat wordt verhoogd tegen het eerste doeleiwit en het primaire antilichaam van het konijn dat tegen het tweede doeleiwit wordt verhoogd. Giet de oplossing uit die het primaire antilichaam bevat. Was vervolgens de vlek door 5 minuten in 20 ml TBST te roeren. Herhaal 4x voor in totaal 5 wasbeurten. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in de secundaire antilichaamoplossing met een Dylight 650 geconjugeerd Goat-antimuisantilichaam en een Dylight 549 geconjugeerd Goat-anti-rabbit antilichaam. Giet de oplossing uit die het primaire antilichaam bevat. Was vervolgens de vlek door 5 minuten in 20 ml TBST te roeren. Herhaal 4x voor in totaal 5 wasbeurten. 7. Beeldvorming en Data-analyse door Image Lab Software- Totale eiwitnormalisatie (~ 5 min) Verkrijg een multiplexing fluorescerende afbeelding van de vlek (Figuur 1E) door een nieuw meerkanaalsprotocol te openen, drie fluorescerende kanalen te configureren en het protocol uit te voeren.Kanaal 1:Toepassing: blot Dylight 650Beeldvormingsgebied: criteriumgelBelichtingstijd van het beeld: automatisch geoptimaliseerd voor de meest intense bandenKanaal 2:Toepassing: blot Dylight 549Beeldvormingsgebied: criteriumgelBelichtingstijd van het beeld: automatisch geoptimaliseerd voor de meest intense bandenKanaal 3:Toepassing: vlekvrije vlekBeeldgebied: criteriumgel Belichtingstijd beeld: automatisch geoptimaliseerd voor de meest intense banden Klik op het normalisatiepictogram in het vak Analysetool en klik op Ja om rijstroken en banden te detecteren. Selecteer en gebruik “Lanes and Bands tools” om indien nodig aanpassingen aan de rijstroken en banden aan te passen. Selecteer vlekvrije afbeelding als normalisatiekanaal. Selecteer MW Analysis Tools en wijs de MW-standaardbanen toe door de vakjes eronder aan te vinken. Als u de genormaliseerde volumes wilt weergeven, klikt u op de analysetabel op de werkbalk. Alle berekeningen worden automatisch uitgevoerd door de software, inclusief de normalisatiefactor en genormaliseerde volumes. De intensiteitswaarden van de doeleiwitband worden nu aangepast voor variatie in de eiwitbelasting. Dit maakt nauwkeurige vergelijkingen van doeleiwitten tussen de monsters mogelijk.

Representative Results

1. Beoordeling van de integriteit van het monster, de kwaliteit van de eiwitscheiding en de overdrachtsefficiëntie met vlekvrije gelafbeeldingen. Eiwitextract uit HeLa-cellen werd gedurende 20 minuten bij 300 V gescheiden op een 18-well Criterion AnyKD TGX vlekvrije gel. De eiwitmonsters werden 3x geladen bij vier verschillende hoeveelheden (Lanes 1-3, 40 μg; Rijstroken 4-6, 30 μg; Rijstroken 7-9, 20 μg; Rijstroken 10-12, 10 μg). De gel werd gedurende 1 min geactiveerd onder UV-licht. Figuur 2A toont het gelbeeld dat direct na de eiwitscheiding is verkregen. De integriteit van eiwitmonsters(bijv. afbraak) en de scheidingskwaliteit(bijv. eiwitprecipitatie) kunnen visueel worden beoordeeld met dit gelbeeld. Eiwitten werden vervolgens gedurende 7 minuten overgebracht naar een nitrocellulosemembraan met trans-Blot Turbo. Figuur 2B toont de vlekvrije afbeelding van de post-transfer gel. Beide beelden werden verworven met dezelfde belichtingstijd (6,8 sec). Rijstrook 3 en 12 werden geselecteerd om de overdrachtsefficiëntie te meten. Met behulp van het volumegereedschap in de Image Lab-software werd een rechthoekig vak (blauw) getekend om baan 3 en 12 op beide gelafbeeldingen te bedekken. Uit de berekening op basis van de volumewaarden uit deze vakken bleek dat de overdrachtsefficiëntie van beide rijstroken 80% bedroeg (figuur 2C). In dit experiment werd de AnyKD TGX-gel geselecteerd om kleine tot middelgrote doeleiwitten te bestuderen en werd deze niet geoptimaliseerd voor de overdracht van grote eiwitten. Het optimaliseren van de overdrachtsefficiëntie vereist het gebruik van gel met een lager percentage(bijv. 4-20%) en/of een aanpassing van de overdrachtstijd om de overdracht van grote eiwitten te vergemakkelijken. 2. Vlekvrije totale eiwitbelastingscontrole is een betrouwbaar alternatief voor huishoudelijke beladingscontrole in westerse blotting om een kleine verandering in het niveau van eiwit van belang te kwantificeren. MCM-7 is een DNA-licentiereplicatiefactor waarvan het niveau met 20-50% afneemt in lymfoblastoïde cellijnen (LCL) na bestralingsbehandeling. In dit experiment werden lysaten (elk 30 μg) van vier met controle en bestraling behandelde lymfoblastoïde cellijn (LCL) culturen gescheiden op een 12-well Criterion AnyKD TGX vlekvrije gel. De gel werd 1 min geactiveerd onder UV-licht en door Trans-Blot Turbo overgebracht naar een PVDF-membraan voor immunoblotting. Het huishoudelijke eiwit GAPDH (groen) werd onderzocht met een konijnantilichaam (Cell Signaling Technology, VS, 1:2.500) en een Dylight 549 geconjugeerd Goat-anti-rabbit anti-rabbit antilichaam (Rockland, USA, 1:20.000). Het eiwit van belang MCM-7 (rood) werd onderzocht met behulp van een muisantilichaam (Abcam, VS, 1:1.000) en een Dylight 649 geconjugeerd Goat-antimuisantilichaam (Rockland, 1:10.000). Figuur 3A toont een multiplex fluorescerend beeld van de totale eiwitten (blauw), MCM-7 (rood) en GAPDH (groen) gedetecteerd in vier met controle en bestraling behandelde LCL-monsters. Figuur 3B is een vlekvrije afbeelding van dezelfde vlek die de totale eiwitpatronen in elk monster weergeeft (30 μg). Image lab-software selecteerde de monsterbanen (blauwe vakken) om MCM-7, GAPDH en het totale eiwitvolume in elke rijstrook te meten. De MCM-7-niveaus werden genormaliseerd tegen de vlekvrije totale eiwitmeting of tegen GAPDH. De genormaliseerde MCM-7 eiwitniveaus werden statistisch geanalyseerd en het gemiddelde MCM-7 eiwitbandvolume en de standaarddeviatie (n=4) worden weergegeven in de grafiek (Figuur 3C). Beide normalisatiemethoden lieten een kleine afname zien (ongeveer 25%) in MCM-7 eiwitniveaus na bestralingsbehandeling. De gegevens met de totale eiwitnormalisatie vertoonden een kleinere standaardafwijking dan die met GAPDH als beladingscontrole. Figuur 1. V3 Westerse workflow. De V3-workflow wordt in 4 stappen in de linkerkolom weergegeven. De belangrijkste instrumenten en reagentia die in de werkstroom worden gebruikt, worden bij elke stap weergegeven. De geschatte tijd voor elke stap is ook inbegrepen. De rechterkolom laat zien dat er minimaal 4 afbeeldingen kunnen worden gegenereerd in de V3-workflow. Het gebruik van elk stukje gegevens wordt beschreven. De vlekvrije afbeeldingen van de pretransfergel, posttransfergel en de vlek (A, B, C) kunnen niet gemakkelijk worden gegenereerd met traditionele westerse blaastechnieken; Deze afbeeldingen en gegevens bieden belangrijke informatie en controlepunten langs de procedure om de controle en reproduceerbaarheid van de westerse vlekworkflow van de wetenschapper te verbeteren. De doeleiwitsignalen kunnen worden vastgelegd op een chemiluminescente vlekafbeelding (D) als een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam werd toegepast bij detectie of op een fluorescerend vlekbeeld (E) als multiplexing fluorescerende westelijke blotting werd uitgevoerd om meer dan één doeleiwit tegelijkertijd op dezelfde vlek te detecteren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. Figuur 2. Vlekvrije afbeeldingen van pretransfer- en posttransfergels in de V3-westernworkflow om de integriteit, scheidingskwaliteit en overdrachtsefficiëntie van het monster te beoordelen. (A) Pretransfer gel vlekvrije afbeelding. (B) Post-transfer gel vlekvrije afbeelding. (C) Eiwitoverdrachtsefficiëntiemeting. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. Figuur 3. Vergelijking van vlekvrije totale eiwitmeting met GAPDH-immunodetection als belastingscontroles om het niveau van interessant eiwit te normaliseren. (A) Fluorescerend westers vlekbeeld. (B) Vlekvrije vlek afbeelding. (C) Genormaliseerde MCM-7 eiwitniveaus. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Discussion

Het hierboven beschreven V3-vlekvrije protocol is voor multiplexing fluorescerende westernblotting. Het kan ook worden toegepast in westerse blotting met behulp van chemiluminescente detectie. In het multiplex fluorescerende western blot protocol worden de vlekvrije vlekbeelden op twee tijdstippen verkregen: 1) direct na eiwitoverdracht; 2) bij de multiplex fluorescente beeldvorming stap na antilichaam incubatie. De eerste vlekvrije afbeelding wordt gebruikt om de overdrachtsefficiëntie te berekenen en de tweede vlekvrije afbeelding wordt gebruikt als beladingscontrole. Wanneer de chemiluminescente methode wordt toegepast, is het niet mogelijk om een multiplexbeeld te maken voor de vlekvrije en doeleiwitsignalen, omdat het chemiluminescente signaal ook in het vlekvrije kanaal zal verschijnen. In dit geval raden we aan om de vlekvrije afbeelding direct na de eiwitoverdrachtstap te gebruiken voor belastingscontrole en normalisatieanalyse.

De V3 western workflow biedt de volgende unieke voordelen ten opzichte van de traditionele western blot workflow die huishoudelijke eiwitten gebruikt als laadregelaars:

Ten eerste biedt de V3-workflow een praktische, handige en betrouwbaardere beladingsregeling om de veranderingen in het niveau van het eiwit van belang te valideren. Het V3-protocol maakt gebruik van een totale eiwitbelastingsregeling om het niveau van het interesseeiwit, gemeten in elk monster, te normaliseren. Het vermijdt twee valkuilen van het gebruik van de huishoudelijke eiwitten als belastingscontroles: verzadigde immunodetection en inconsistente expressieniveaus van huishoudelijke eiwitten onder de monsters onder bepaalde experimentele omstandigheden. Strippen en reprobing stappen met antilichamen gericht tegen het huishouden zijn niet langer nodig. Met behulp van vlekvrije technologie is het niet nodig om een vlek te beitsen en te de-beitsen met vlekken zoals Coomassie of Sypro Ruby voor totale eiwitmeting. Het duurt slechts een paar seconden om een vlekafbeelding te verkrijgen en ongeveer 5 minuten om totale eiwitnormalisatie uit te doen met behulp van Image Lab-software.

Ten tweede stelt de V3-workflow wetenschappers in staat om de westerse procedure beter te controleren, omdat het de procedure transparanter maakt en verschillende controlepunten voor kwaliteitscontrole introduceert. Met behulp van vlekvrije technologie kunnen onderzoekers hun eiwitmonsters visualiseren op zowel de gel als de vlek. Wetenschappers kunnen de integriteit van eiwitmonsters (gedegradeerd of niet), scheidingskwaliteit (al dan niet neergeslagen), overdrachtsefficiëntie en overdrachtskwaliteit (zelfs overdracht of niet) beoordelen. Deze controlepunten helpen onderzoeken het experiment te beëindigen bij het zien van grote gebreken in het proces en voorkomen dat ze tijd verspillen aan slechte monsters en vlekken. Deze technologie helpt wetenschappers ook te beoordelen of er een aanzienlijke hoeveelheid eiwitverlies is na het strippen van het membraan en of de vlek geschikt is voor het weerleggen van een ander doel 4.

Hier zijn een paar tips om een goede ervaring en kwaliteitsgegevens te garanderen met behulp van V3 western workflow.

  1. Afbeelding van de gel onmiddellijk na gel run. Week de gel niet in een buffer vóór de eerste beeldvorming in de procedure, omdat deze de vlekverbinding kan wegspoelen.
  2. Gebruik hetzelfde beeldgebied om alle afbeeldingen in het protocol te verkrijgen. Hierdoor kan de software afbeeldingen overlappen voor gegevensanalyse, zoals totale eiwitnormalisatie.
  3. Houd de belichtingstijd consistent bij het in beeld brengen van de pretransfer- en posttransfergels. Hierdoor kan de software de overdrachtsefficiëntie kwantitatief meten.
  4. Houd het membraan nat met een paar druppels water of TBST bij het verkrijgen van het vlekbeeld. Dit voorkomt mogelijke vuile achtergrondproblemen voor doeleiwitdetectie.
  5. Gebruik een laag fluorescerend PVDF-membraan voor multiplexing fluorescerende westelijke blotting.

Het is belangrijk op te merken dat het vlekvrije molecuul na UV-activering onomkeerbaar gebonden is aan tryptofaanresten. Deze onomkeerbare modificatie kan mogelijk van invloed zijn op de herkenning van antigeen bij het gebruik van monoklonale antilichamen als de epitoop tryptofaan bevat. Polyklonale antilichamen zullen waarschijnlijk niet worden aangetast omdat ze meerdere epitopen op het antigeen herkennen. Ongebonden vlekvrije moleculen kunnen gemakkelijk van de gel en het membraan worden gewassen en zullen daarom de antilichaam-antigeeninteracties niet verstoren.

Kortom, de V3 western workflow maakt het western vlek proces sneller, transparanter, kwantitatiever en betrouwbaarder. Onderzoekers kunnen nu eenvoudig totale eiwitbelastingscontrole toepassen in een westers vlekexperiment om hun gegevens betrouwbaarder te maken. De V3-vlekvrije workflow is overgenomen door een aantal laboratoria en hun publicaties hebben aangetoond dat tijdschriften vlekvrije gegevens accepteren als beladingscontrole in western blot22,17,7,8,5,23,18,15.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs danken Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi en Jeff Durban voor hun kritische beoordeling en bewerking van dit manuscript. De auteurs bedanken allison Schwartz ook voor de technische ondersteuning.

Materials

REAGENTS
4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel Bio-Rad 567-8093 Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment
Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs Bio-Rad 170-4157 Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml Bio-Rad 170-5061
[header]
EQUIPMENT
Criterion Cell Bio-Rad 165-6100
Trans-Blot Turbo Transfer Starter System Bio-Rad 170-4155
ChemiDoc MP System Bio-Rad 170-8280
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting. J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).
  2. Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia. J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).
  3. Castaño, Z., Kypta, R. M. Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation. Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).
  4. Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
  5. Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).
  6. Dittmer, A., Dittmer, J. Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis. Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).
  7. Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers. J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).
  8. Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney. Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).
  9. Eslami, A., Lujan, J., Western, Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), (2010).
  10. Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies. Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).
  11. Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).
  12. Gürtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis. Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).
  13. Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis. Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).
  14. Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).
  15. Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage. DNA Repair. , (2013).
  16. Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark. Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).
  17. Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).
  18. Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRYΑA Associated with Congenital Cataract in a South Australian. , (2012).
  19. Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. Identification and validation of rice reference proteins for western blotting. J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).
  20. Liu, N. K., Xu, X. M. Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
  21. Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).
  22. Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans. J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).
  23. Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. . Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).
  24. Neill, U. S. All Data are not created Equal. J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).
  25. Pérez-Pérez, R., López, J. A., García-Santos, E., Camafeita, E., Gómez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fernández-Real, J. M., Peral, B. Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity. PLoS One. 7 (1), (2012).
  26. Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development. PLoS One. 7 (8), (2012).
  27. Romero-Calvo, I., Ocón, B., Martínez-Moya, P., Suárez, M. D., Zarzuelo, A., Martínez-Augustin, O., de Medina, F. S. Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots. Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).
  28. Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro. BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).
  29. Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots. Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).
  30. Welinder, C., Ekblad, L. Coomassie staining as loading control in Western blot analysis. J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).
  31. You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease. Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).

Tags

Western BlotStain-free TechnologyTotal Protein Loading ControlProtein QuantificationWorkflow OptimizationTransfer Efficiency VerificationHousekeeping Proteins

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Posch, A., Kohn, J., Oh, K., Hammond, M., Liu, N. V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting. J. Vis. Exp. (82), e50948, doi:10.3791/50948 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image