Sanal Gerçeklik Çevre gezinme Farelerde iki foton Kalsiyum Görüntüleme
Summary
Burada bir sanal gerçeklik ortamında davranış sırasında fare korteksin iki foton görüntüleme katılan deneysel işlemleri.
Abstract
Bu davranış 1-6 işlemleri sırasında genetik olarak tanımlanmış olan hücrelerin faaliyetinin kronik ölçümü için izin verdiği Son yıllarda, iki foton görüntüleme, nörolojik çok değerli bir araç haline gelmiştir. Burada hayvan bir sanal gerçeklik ortamı gider iken fare kortekste iki foton görüntüleme gerçekleştirmek için yöntemleri tarif. Biz bir aydınlık sanal ortamda bir davrandığını hayvan görüntüleme için anahtar deneysel prosedürlerin yönlerine odaklanmak. Burada adres vardır, bu deney düzeneği ortaya çıkan temel sorunları:, beyin hareket ilgili eserler minimize sanal gerçeklik projeksiyon sistemi ışık sızıntısı en aza indirmek, ve lazer kaynaklı doku hasarı en aza indirmek. Biz de sanal gerçeklik ortamı kontrol etmek ve öğrenci izleme yapmak için örnek yazılım sağlarlar. Bu işlemler ve kaynak ile bu fareler davranmak kullanılmak için geleneksel bir iki-fotonlu mikroskop dönüştürmek mümkün olmalıdır.
Introduction
(Genetik GCaMP5 7 ya da R-geco 8 ya da OGB veya Fluo4 gibi sentetik boyalar gibi kodlanmış) kalsiyum göstergeleri iki foton görüntüleme farelere 1-6 davranmak nöronal etkinliği ölçmek için bir güçlü bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Yaklaşık 800 um beyin yüzeyinden 9,10 altına kadar yakın bir hareket potansiyeli çözünürlükte hücre yüzlerce aktivitesinin aynı anda ölçüm sağlar. Ayrıca, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GeCIS) kullanılarak nöron faaliyeti kronik 5,11,12 ölçülebilir ve genetik olarak tanımlanmış hücre tiplerinde 13. Hep birlikte, bu yöntem, in vivo nöronal hesaplama çalışmada yeni olanaklar bir çok açmak zamansal ve uzamsal çözünürlük derecesi sağlar.
Cerrahi müdahale görüntüleme için fare beyin ortaya çıkarmak ve etiketlemek için gereklidir. Hücreler tipik olarak, bir rekombinant adeno-ilişkili Vir kullanılarak transfekte edilir GECI teslimat ve bir kafatası pencere için bize (AAV) sistemi beyne optik erişmek için enjeksiyon sitesi üzerinden implante edilir. Bir kafa çubuğu daha sonra iki foton mikroskop altında kafa sabitleme için kafatasına bağlı. Uyanık görüntüleme ile sorunların çoğu hazırlanmasında istikrarsızlıklar kaynaklanır olarak bu adımların tasarım ve uygulama önemlidir. İdeal olarak burada tarif edilen ameliyat sonrası birkaç aya kadar kronik görüntüleme için izin vermelidir.
Iki foton görüntüleme sırasında görsel olarak yönlendirilen davranışını etkinleştirmek için, kafa sabit fare bir sanal gerçeklik ortamı gezinmek için kullanabileceğiniz bir hava destekli küresel koşu bandı, oturur. Yürüme bandı üzerinde fare hareket fare 14,15 çevreleyen toroidal bir ekran üzerinde görüntülenen sanal ortamda hareketine bağlıdır. Bu tür hareketlilik, görsel uyaran ve gözbebeği konumunda gibi davranışsal değişkenler 6 kaydedilebilir.
t "> bir sanal gerçeklik ortamı keşfetmek farelerde kronik iki foton görüntüleme dahil prosedürlerini açıklar hitaben önemli noktalar vardır:. hareket eserler azalma, hafif sızıntı azaltılması, eş zamanlı olarak kaydedilen hücrelerinin sayısının maksimizasyonu ve minimizasyonu fotoğraf hasar. Ayrıca hava destekli koşu bandı, öğrenci takibi, ve sanal gerçeklik ortamı kurma hakkında ayrıntılı bilgi vermektedir. Burada anlatılan prosedürler davranışsal paradigmalar bir potansiyel çeşitli kafa sabit farelerde floresan etiketli hücre popülasyonlarının görüntüleme için kullanılabilir .Protocol
Representative Results
Discussion
Davranış iki foton görüntüleme başarısı için en önemli iki yolla preparatın stabilitesi olan:
- Gün sonra pencere implantasyon boyunca, doku iltihaplı tepkiler granülasyon doku ve engel ya da görüntülemesi önleyecektir kıkırdak oluşumunun geliştirilmesi yol açabilir.
- Deney sırasında beyin sinirsel aktivite ile ilgili floresan sinyalini bozarak dan hareket eserler önlemek için yeterince kararlı olmak zorundadır.
Kranial pencere implantas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Biyomedikal Araştırma Friedrich Miescher Enstitüsü, Max Planck Derneği ve İnsan Frontiers Bilim Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| cover slips (d = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12kHz resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16x, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).
- Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).
- Akerboom, J., Chen, T. -. W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).
- Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).
- Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
- Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
- Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).
