建立浮星细胞（MBC-P）和生物膜细胞（MBC-B）抗菌剂的最小杀菌浓度
Summary
该协议允许使用 96 井微蒂板直接比较浮石和生物膜耐药性，以识别细菌菌株 ，从而在体外 形成生物膜。浮游生物或生物膜细菌暴露在首选抗菌剂的连续稀释中。活力被阿加板块的生长所测定。
Abstract
该协议允许浮石和生物膜耐药性之间的直接比较的细菌菌株，可以形成一个生物膜 体外。细菌被接种到96井微质板的井中。在浮游生物检测中，选择的抗菌剂的连续稀释被添加到细菌悬浮剂中。在生物膜检测中，一旦接种，细菌就会在一定的时间内形成生物膜。未连接的细胞从井中去除，媒体补充，并添加选择的抗菌剂的连续稀释。接触抗菌剂后，浮石细胞被检测为生长。对于生物膜检测，媒体刷新了缺乏抗菌剂的新鲜介质，生物膜细胞有留给恢复。生物膜细胞的生存能力在恢复期后被检测。抗菌剂的MBC-P被定义为杀死浮石培养细胞的药物浓度最低。 相比之下，菌株的 MBC-B 通过将预制生物膜暴露在 24 小时内抗菌剂浓度增加的程度来确定。MBC-B 被定义为杀死生物膜中细胞的抗菌剂的最低浓度。
Introduction
抗生素耐药性检测最初是为了检测浮游生物（自由游泳）细菌培养物的耐药性而开发的。由于许多细菌感染涉及生物膜（表面连接细胞），我们有兴趣开发一种检测生物膜特异性抗生素耐药性的方法。然而，大多数抗生素耐药性检测不适合测量生物膜的耐药性。例如，确定最低抑制浓度（MIC）是确定浮石细菌培养物 1抗生素耐药性的黄金标准。这种检测需要将稀释的浮石培养物与稀释系列抗生素混合。 抑制浮石细胞可见生长的抗生素浓度是MIC。由于这种检测依赖于对生长的抑制，根据定义，它不能与生物膜培养物配合使用，这需要检查预生生物膜中细胞的抗生素敏感性。此处描述的 MBC-B 检测结果不是测量生长抑制，而是确定杀死生物膜中已有细胞的抗生素浓度。因此，这种检测旨在模仿已建立的生物膜感染的抗生素治疗，并提供一个更相关的视野 中的细菌抗生素耐药性。
由于生物膜通常比浮石培养物2-4更具抗生素耐药性，因此有必要设计出一种将生物膜的抗生素耐药性与浮石培养物直接相关的方法。因此，这种方法的另一个目标是能够直接比较浮石细胞和生物膜细胞之间的抗生素耐药性水平。此处描述的 MBC-P 和 MBC-B 分析使这一点成为可能，因为细胞是在类似条件下培养的。我们利用这种方法研究了几个对生物膜特异性抗生素耐药性很重要的基因。
Protocol
Representative Results
Discussion
浮石细胞中的抗生素耐药性被定义为由于细胞的永久变化（如 突变）而增加抗生素的最低抑制浓度 （MIC）。迄今已查明的生物膜特异性抗性或耐受性机制是生物膜中野生类型基因表达的结果。因此，抗药性的经典定义不适用于生物膜。然而，另一组定义已经提出：耐药性机制阻止抗生素进入其目标，而耐受性机制关闭抗生素的目标10。生物膜特异性抗生素耐药性机制包括这两个定?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢李章、李贤志、阿龙·欣兹和克莱顿·霍尔对这份手稿的编辑帮助。这种检测最初是在达特茅斯盖塞尔医学院乔治·奥图尔的实验室中开发的。Mah博士实验室的研究得到了加拿大自然科学和工程研究理事会和加拿大囊性纤维化研究理事会的资助。
Materials
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1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
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KH2PO4 |
Fisher |
P285-500 |
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K2HPO4 |
Fisher |
P288-500 |
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(NH4)2SO4 |
Sigma |
A5132 |
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Magnesium sulfate |
Fisher |
M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
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Tobramycin |
Sigma |
Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at –20°C. |
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Arginine |
Sigma |
A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
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96-well microtiter plates |
Corning |
3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
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Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech |
2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
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Multiprong device |
Dan-Kar |
MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
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