إنشاء الحد الأدنى من تركيز مبيد الجراثيم لعامل مضاد للميكروبات للخلايا العوالق (MBC-P) وخلايا بيو فيلم (MBC-B)
Summary
يسمح هذا البروتوكول بإجراء مقارنة مباشرة بين مقاومة العوالق والبيو فيلم لسلالة بكتيرية يمكن أن تشكل بيو فيلم في المختبر باستخدام لوحة ميكروتتر 96 بئرا. تتعرض بكتيريا العوالق أو الأغشية الحيوية لتخفيف متسلسل للعامل المضاد للميكروبات المفضل. يتم اختبار الجدوى من خلال النمو على لوحات أجار.
Abstract
يسمح هذا البروتوكول بإجراء مقارنة مباشرة بين مقاومة العوالق والبيو فيلم لسلالة بكتيرية يمكن أن تشكل بيو فيلم في المختبر. يتم تلقيح البكتيريا في آبار لوحة ميكروتتر 96 بئرا. في حالة المقايسة العوالق ، يتم إضافة التخفيفات التسلسلية للعامل المضاد للميكروبات المفضل إلى التعليق البكتيري. في الفحص الحيوي ، بمجرد تلقيحها ، يتم ترك البكتيريا لتشكيل بيو فيلم على مدى فترة زمنية محددة. تتم إزالة الخلايا غير المرفقة من الآبار ، ويتم تجديد الوسائط وإضافة التخفيفات التسلسلية للعامل المضاد للميكروبات المفضل. بعد التعرض لعامل مضادات الميكروبات ، يتم فحص الخلايا العوالق للنمو. بالنسبة للآساءة بيو فيلم، يتم تحديث وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الطازجة تفتقر إلى عامل مضاد للميكروبات وتترك خلايا بيو فيلم لاسترداد. يتم فحص صلاحية الخلية بيو فيلم بعد فترة الانتعاش. يتم تعريف MBC-P لعامل مضادات الميكروبات على أنه أقل تركيز للدواء يقتل الخلايا في الثقافة العوالق. في المقابل ، يتم تحديد MBC-B لسلالة من خلال تعريض الأغشية الحيوية مسبقة التشكيل لتركيزات متزايدة من عامل مضادات الميكروبات لمدة 24 ساعة. يعرف MBC-B بأنه أقل تركيز للعامل المضاد للميكروبات الذي يقتل الخلايا في الفيلم الحيوي.
Introduction
تم تطوير مقايسات مقاومة المضادات الحيوية في البداية لتقصي مقاومة الثقافات العوالق (السباحة الحرة) للبكتيريا. نظرا لأن العديد من العدوى البكتيرية تنطوي على الأغشية الحيوية (الخلايا المرفقة بالسطح) ، فقد كنا مهتمين بتطوير طريقة لتقصي مقاومة المضادات الحيوية الخاصة بالبيو فيلم. ومع ذلك ، فإن معظم المقايسات مقاومة المضادات الحيوية غير مناسبة لقياس مقاومة الأغشية الحيوية. على سبيل المثال، تحديد الحد الأدنى من التركيز المثبط (MIC) هو المعيار الذهبي لتحديد مقاومة المضادات الحيوية للثقافات البكتيرية العوالق 1. هذا المقايسة ينطوي على خلط ثقافة العوالق المخففة مع سلسلة من المضادات الحيوية المخففة. تركيز المضادات الحيوية التي تمنع النمو المرئي للخلايا العوالق هو هيئة التصنيع العسكري. وبما أن هذا الفحص يعتمد على تثبيط النمو ، بحكم تعريفه ، فإنه لا يمكن أن يعمل مع ثقافات بيو فيلم ، الأمر الذي يتطلب فحص حساسية المضادات الحيوية للخلايا في بيو فيلم متضخمة مسبقا. بدلا من قياس تثبيط النمو، يحدد المقايسة MBC-B الموصوفة هنا تركيز المضادات الحيوية التي تقتل الخلايا الموجودة بالفعل في بيو فيلم. وهكذا، يهدف هذا الفحص إلى محاكاة العلاجات بالمضادات الحيوية لالتهابات بيو فيلم الراسخة، وتوفير رؤية أكثر ملاءمة لمقاومة المضادات الحيوية البكتيرية في الجسم الحي.
منذ biofilms عموما أكثر مقاومة للمضادات الحيوية من الثقافات العوالق 2-4 ، كان من الضروري وضع طريقة تربط مباشرة مقاومة المضادات الحيوية من بيو فيلم إلى أن من ثقافة العوالق. وبالتالي فإن الهدف الآخر من هذه الطريقة هو أن تكون قادرة على مقارنة مباشرة مستوى مقاومة المضادات الحيوية بين الخلايا العوالق والبيو فيلم. إن المقايسات MBC-P و MBC-B الموصوفة هنا تجعل هذا ممكنا لأن الخلايا يتم استزراعها في ظروف مماثلة. لقد استخدمنا هذه الطريقة لدراسة العديد من الجينات التي تعتبر مهمة لمقاومة المضادات الحيوية الخاصة بيو فيلم 5-8 .
Protocol
Representative Results
Discussion
تعرف مقاومة المضادات الحيوية في الخلايا العوالق بأنها زيادة في الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) للمضادات الحيوية بسبب التغير الدائم في الخلايا(مثل الطفرة). آليات المقاومة أو التسامح بيو فيلم محددة التي تم تحديدها حتى الآن هي نتيجة للتعبير عن الجينات نوع البرية داخل الأغشية الحيوية. وب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلف أن يشكر لي زانغ، وشيان زي لي، وآرون هينز، وكلايتون هول على المساعدة التحريرية في هذه المخطوطة. تم تطوير هذا المقايسة في البداية في مختبر جورج أوتول، كلية جيزيل للطب في دارتموث. ويدعم البحث في مختبر الدكتور ماه من المنح المقدمة من مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا والتليف الكيسي كندا.
Materials
|
1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
|
KH2PO4 |
Fisher |
P285-500 |
|
|
K2HPO4 |
Fisher |
P288-500 |
|
|
(NH4)2SO4 |
Sigma |
A5132 |
|
|
Magnesium sulfate |
Fisher |
M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
|
Tobramycin |
Sigma |
Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at –20°C. |
|
|
Arginine |
Sigma |
A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
|
96-well microtiter plates |
Corning |
3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
|
Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech |
2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
|
Multiprong device |
Dan-Kar |
MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
- Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
- Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.3.1-1B.3.14 (2005).
